穩(wěn)定型螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

Steady Firefly Luciferase reporter Assay Kit

產(chǎn)品原理：

螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是一種以熒光素(luciferin，也稱螢光素)為底物， 檢測(cè)熒光素酶(firefly luciferase， 也稱螢光素酶)活性的試劑盒。螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 KD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下， 可以催 化luciferin氧化成oxyluciferin。在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物發(fā)光(bioluminescence)。生物發(fā)光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

通過熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。通常把所研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或 5’啟動(dòng)子區(qū)克隆在luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase基因的下游， 構(gòu)建成報(bào)告基因(reporter gene)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適當(dāng)方法處理細(xì)胞后，測(cè)定熒光素酶的活性。通過熒光素酶活性的高低，來判斷處理方法對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。

保存條件：

-20oC避光保存6個(gè)月有效，-80oC避光保存，一年有效。盡量避免反復(fù)凍融。

使用方法：

1. 室溫下融解穩(wěn)定型熒光素酶檢測(cè)試劑，同時(shí)將培養(yǎng)好的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，在二者都達(dá)到室溫且溫度*時(shí)，開始下一步實(shí)驗(yàn)；

2. 向細(xì)胞加入與培養(yǎng)基等體積的穩(wěn)定型熒光素酶檢測(cè)試劑，并在室溫下平緩振搖孵育至少5分鐘，以使細(xì)胞充分裂解，此過程可以用錫箔紙覆蓋避光。不論細(xì)胞培養(yǎng)在何種器皿中，加入與培養(yǎng)基等體積的熒光素酶檢測(cè)試劑即可；

3. 開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀，設(shè)置適當(dāng)參數(shù)；

4. 進(jìn)行讀數(shù)，可以直接在96孔板或384孔板中讀數(shù)，也可以吸出100-200微升到發(fā)光管中進(jìn)行讀數(shù)。本產(chǎn)品信號(hào)值非常穩(wěn)定，半衰期大于5小時(shí)，可達(dá)到高通量篩選的要求。

螢光素酶報(bào)告基因的主要優(yōu)點(diǎn)：

穩(wěn)定型螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的優(yōu)點(diǎn)

1. 靈敏度高，zui低可檢測(cè)10^‐20摩爾熒光素酶分子，比Western Blot靈敏度高1000倍以上；

2. 檢測(cè)范圍廣，在10^-16 M(10 pg/L)至10^-8 M(1 mg/L)范圍內(nèi),光強(qiáng)度與熒光素酶濃度成正比；

3. 發(fā)光檢測(cè)，檢測(cè)方便，內(nèi)源性低，哺乳動(dòng)物無內(nèi)源性表達(dá)，熒光素酶檢測(cè)不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；

4. 試劑盒成分經(jīng)過優(yōu)化處理，可以使信號(hào)值保持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定，半衰期大于5小時(shí)，非常適合高通量篩選的要求。

主要應(yīng)用領(lǐng)域

1、啟動(dòng)子核心區(qū)域檢測(cè)，增強(qiáng)子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測(cè)；

2、啟動(dòng)子/增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)；

3、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究；

4、病毒/細(xì)胞相互作用；

5、藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素或射線等物理誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強(qiáng)）。

注意事項(xiàng)：

1. 常見培養(yǎng)基如RPMI1640、DMEM、F-12、MEM等，以及酚紅、血清、PBS和其他緩沖液等，都不影響熒光素酶檢測(cè)試劑的使用。穩(wěn)定型熒光素酶檢測(cè)試劑經(jīng)過成分優(yōu)化處理，可使信號(hào)值保持穩(wěn)定，半衰期大于5小時(shí)，非常適合高通量篩選的要求。

2. 由于溫度對(duì)酶反應(yīng)有影響，所以樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。

3. 為保證熒光素酶檢測(cè)試劑的穩(wěn)定，可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長(zhǎng)時(shí)間暴露于室溫；經(jīng)測(cè)試，反復(fù)凍融三次，對(duì)測(cè)定結(jié)果無明顯影響。

4. 細(xì)胞如果在96孔或384孔板中直接讀數(shù)，需要使用白色或黑色不透明的培養(yǎng)板，以免發(fā)生孔與孔之間的信號(hào)干擾。

5. 為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)細(xì)胞時(shí)效率的差異而帶來的誤差，可以同時(shí)轉(zhuǎn)入海腎熒光素酶(Renilla luciferase)的報(bào)告基因質(zhì)?；颚?半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)的報(bào)告基因質(zhì)粒等作為內(nèi)參。

6. 本產(chǎn)品*于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常見問題：

1. Luminometer和熒光分光光度計(jì)有何不同？ 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)的樣品本身不能發(fā)光，樣品需要由特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，然后才能產(chǎn)生熒光并被熒光分光光度計(jì)檢 測(cè)。Luminometer檢測(cè)的樣品本身可以發(fā)光，不需要激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測(cè)化學(xué)發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號(hào)的熒光分光光度計(jì)也具有l(wèi)uminometer的功能，即也可以檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計(jì)能否用于化學(xué)發(fā)光的測(cè)定請(qǐng)仔細(xì)閱讀該儀器的說明書，或咨詢儀器供應(yīng)商。

2. 可以進(jìn)行ATP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測(cè)？ 是。ATP化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)原理和本試劑盒的原理相同，可以用相同的儀器測(cè)定。