細(xì)說(shuō)Western Blot

與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)方便且通用的好方法。

western顯色的方法主要有以下幾種：

1）放射自顯影

2）底物化學(xué)發(fā)光ECL

3）底物熒光ECF

4）底物DAB呈色

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

操作步驟(一)  配膠

1）注意一定要將玻璃板洗凈，然后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。

2）灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。

待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。

3）灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^(guān)的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。(10%的AP建議現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過(guò)兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，建議棄掉.)

(二) 樣品處理

1．培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：

⑴去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

⑵對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。

⑶ 100℃，1min。

⑷用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex2~3次。

⑸用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒(méi)有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無(wú)團(tuán)塊也無(wú)絲狀物但溶液有些粘稠，可通過(guò)使用1ml注射器反復(fù)抽吸來(lái)降低溶液粘滯度，便于上樣。

⑹待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。

2．培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：

⑴去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

⑵加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸取少量上清進(jìn)行定量。

⑹將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3．組織：

⑴勻漿  對(duì)于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶取少量上清進(jìn)行定量。

⑷將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巰基醇，0.2~0.5‰溴酚藍(lán)，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過(guò)10%。對(duì)于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)

(三) 電泳

1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。

2．所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。

2．以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳。

3．在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。

電泳液配方：Tris-base 3g,  glycine 14.4g,  0.1% SDS（10ml 10%SDS）/L

Tris-base 1.5g,  glycine 7.2g, 0.1% SDS（5ml 10% SDS）/0.5L

(四) 轉(zhuǎn)膜

1．電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開(kāi)始準(zhǔn)備：

濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris3.0g，Gly 14.4g， M-OH200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS  180ul。浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再?zèng)]入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。

2．取膠：

將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過(guò)多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）

3．轉(zhuǎn)膜：

濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過(guò)夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過(guò)1V/cm2膠面積。

電轉(zhuǎn)液配方： Tris-base 3g,  glycine 14.4g,  200ml 甲醇/1L

(五)  封閉及雜交

1．封閉：

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀(guān)察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2．結(jié)合一抗：

一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4℃靜置過(guò)夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過(guò)多蒸發(fā)。

3．洗滌：

一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．結(jié)合二抗：

根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋?zhuān)?:1000~1:10000），室溫輕搖一小時(shí)。

5．洗滌：

二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

PBST： 1×PBS                    TTBS： Tris-HCl  20mM,pH 7.4 (25℃)

Tween-20  0.01% ~0.02%           NaCl      150mM

Tween-20   0.05%

封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時(shí)取200ml PBST或 TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。

(六) 發(fā)光鑒定

一般使用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1．HRP-ECL發(fā)光法：

將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A(yíng)、B混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即沒(méi)入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完成定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè) EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過(guò)的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線(xiàn)，顯色20s后每10s觀(guān)察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀(guān)察與掃描。背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果暴光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半小時(shí)，出現(xiàn)背景是正常的。

(七) NC膜的多次使用

一張NC膜可使用多次，對(duì)多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七．增強(qiáng)敏感性"相近。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min×3次）后從一抗雜交開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫?fù)u動(dòng)洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再?gòu)姆忾]開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。

對(duì)于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液（可用雜交袋）于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再?gòu)姆忾]開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。

注意事項(xiàng)增強(qiáng)敏感性，若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：

1）用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長(zhǎng)曝光時(shí)間。

2）將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長(zhǎng)，期間至少換2次液。

3）封閉40~60min一抗雜交，室溫1h。

4）37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。

5）PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

6）二抗雜交，37℃ 1h。

7）PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

8）發(fā)光鑒定。

9）若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

10）三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時(shí)三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。

11）PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

12）發(fā)光鑒定。一抗溶液中加入0.2% 疊氮鈉后可4℃存放至少2周（一個(gè)月我也用過(guò)，沒(méi)問(wèn)題，再長(zhǎng)時(shí)間還沒(méi)試）