閃晶生物地理位置圖,點擊放大!閃晶生物為您提供全套免疫印跡(western blot)技術(shù)服務(wù)和相關(guān)的試劑耗材。主要實驗步驟如下：
蛋白質(zhì)抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
實驗對象為細(xì)胞樣品每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個孔中，電泳分離蛋白。
4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育
膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。
封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。
加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。
6. western blot結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
8. 提供實驗報告，包括詳細(xì)的實驗方法及免疫印跡實驗結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。
采購中心
