CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，圖片來(lái)自于McGovern Institute for Brain Research at MIT

2020年10月，Jennifer A. Doudna（加州大學(xué)伯克利分校）和Emmanuelle Charpentier（馬克斯普朗克研究所）因 “開(kāi)發(fā)了一種基因組編輯技術(shù)”共同榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

自此，CRISPR基因編輯技術(shù)，這一名副其實(shí)的“基因剪刀手”技術(shù)，通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因DNA片段進(jìn)行刪除、替換、插入、定點(diǎn)突變等“精確編輯”操作，以獲得新的功能或表型，甚至創(chuàng)造新的物種，成為了風(fēng)靡全球生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室的寵兒，被廣泛應(yīng)用于大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅等動(dòng)植物（細(xì)胞）及細(xì)菌等微生物的基因組靶向改造，并已在功能基因組研究、疾病防治、動(dòng)植物育種、動(dòng)物疾病模型開(kāi)發(fā)、基因治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

正如《自然》雜志2021年科學(xué)新聞的介紹中所說(shuō)：“CRISPR基因編輯技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，一直被視為治療疾病的規(guī)則改變者。但是，要使這個(gè)夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)，許多疾病將需要研究人員成功地將CRISPR-Cas9植入人體，并證明它安全有效地編輯了目標(biāo)基因。”

01、斑馬魚(yú)與CRISPR基因編輯技術(shù)

2013年2月，CRISPR/Cas9技術(shù)被成功應(yīng)用于斑馬魚(yú)；2015年，來(lái)自美國(guó)NIH的研究人員進(jìn)行了一項(xiàng)研究，他們利用CRISPR-CAS9技術(shù)靶向斑馬魚(yú)特定DNA序列進(jìn)行基因功能探索和人類治病基因的發(fā)現(xiàn)研究，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Genome Research。（doi:10.1101/gr.186379.114）

在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術(shù)CRISPR-CAS9進(jìn)行斑馬魚(yú)基因靶向識(shí)別以及插入刪除特定基因的效率可以達(dá)到其他技術(shù)的6倍。同時(shí)，利用CRISPR-CAS9技術(shù)還能夠在同一時(shí)間對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行靶向突變，為研究基因功能提供了很大便利。

CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)技術(shù)能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)基因組敲除等編輯功能，因而，成為了一種對(duì)微生物、動(dòng)植物以及人類基因組進(jìn)行基因篩選、修飾的強(qiáng)有力工具。

CRISPR-Cas9 在全基因組篩選中，不僅可以靶向蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，還可以靶向基因調(diào)控區(qū)域；不僅可以靶向DNA，還可以靶向microRNA、lncRNA 等 RNA序列等。在醫(yī)療保健領(lǐng)域，CRISPR-Cas9基因編輯為治愈遺傳病、癌癥，乃至心臟病等重大疾病帶來(lái)了希望。

斑馬魚(yú)，作為一種已完成基因測(cè)序的模式生物，其與人類基因同源性高達(dá)87%，且具有飼養(yǎng)成本低、產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短、透明易觀察等優(yōu)點(diǎn)，在進(jìn)行高通量篩選、基因編輯時(shí)具有其他動(dòng)物不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

復(fù)雜的基因編輯加上實(shí)時(shí)高分辨率成像，分子細(xì)節(jié)和分辨率對(duì)疾病發(fā)展過(guò)程進(jìn)行捕捉以及疾病的建模。

至關(guān)重要的是，對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行精確的基因編輯，可以生成人類疾病等位基因的模型，在斑馬魚(yú)身上建模的疾病通常代表了人類疾病的真實(shí)模型，捕捉了疾病的病因?qū)W、進(jìn)展和解決過(guò)程，廣泛應(yīng)用于各種癌癥、遺傳病、肝臟疾病、心腦血管疾病、血液疾病、心臟病、行為障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等等。

通過(guò)斑馬魚(yú)CRISPR基因編輯技術(shù)，不僅可以用來(lái)評(píng)價(jià)人類基因的作用與功能、解析其在遺傳與發(fā)育上發(fā)揮作用的分子機(jī)制，而且可以通過(guò)基因組改造（基因敲除、敲入和轉(zhuǎn)基因等）構(gòu)建先天性心臟病、慢性心衰、擴(kuò)張型心肌病、癌癥等各種人類疾病的斑馬魚(yú)模型，表型模擬人類疾病的病癥，通過(guò)高通量藥物篩選技術(shù)，用于篩選和發(fā)現(xiàn)相關(guān)的治療靶點(diǎn)藥物和化合物，研究分子遺傳病的病理機(jī)制、確認(rèn)疾病的致病基因、開(kāi)發(fā)基因治療的生物藥等生物醫(yī)藥的研發(fā)，從而助力人類健康醫(yī)學(xué)的研究與實(shí)驗(yàn)新發(fā)現(xiàn)。

02、環(huán)特生物的基因編輯技術(shù)服務(wù)

環(huán)特生物提供各種斑馬魚(yú)CRISPR基因敲入、敲除、定制轉(zhuǎn)基因技術(shù)服務(wù)以及斑馬魚(yú)疾病模型開(kāi)發(fā)等相關(guān)服務(wù)，助力基因功能研究。斑馬魚(yú)基因敲入技術(shù)與基因置換技術(shù)，為您利用斑馬魚(yú)遺傳模型鋪平道路，與您攜手推動(dòng)生物科學(xué)和人類健康事業(yè)發(fā)展！

基因敲除技術(shù)

定義：根據(jù)給定GeneID或Gene name，分析基因保守結(jié)構(gòu)域，在保守結(jié)構(gòu)域或客戶區(qū)域設(shè)計(jì)靶點(diǎn)并制備靶點(diǎn)gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因產(chǎn)生移碼突變，通過(guò)PCR篩選得到穩(wěn)定遺傳品系。

技術(shù)特點(diǎn)：

通過(guò)將基因敲除斑馬魚(yú)品系與野生型相比較，研究者可以揭示特定基因的功能；

在基因組水平上將目標(biāo)基因敲除，遺傳背景干凈清晰，是研究基因功能的金標(biāo)準(zhǔn)。

服務(wù)流程：

▲根據(jù)客戶提供的GeneID或Gene name進(jìn)行基因分析；

▲cas9 mRNA和多個(gè)gRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及合成；

▲高效gRNA靶點(diǎn)的篩選及效率驗(yàn)證；

▲F0代斑馬魚(yú)的可遺傳性篩選；

▲雜合子F1代斑馬魚(yú)的基因型鑒定。

定制轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)

定義：斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括顯微注射、電穿孔技術(shù)（電脈沖介導(dǎo)）、jingzi載體法、GAL4/UAS 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)、Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)、擬型反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)、重組桿狀病毒介導(dǎo)等方法。

技術(shù)目的：

通過(guò)定點(diǎn)敲除技術(shù)進(jìn)行基因鑒定和功能研究；

利用報(bào)告基因?qū)κ荏w等蛋白質(zhì)進(jìn)行功能研究；

構(gòu)建各種斑馬魚(yú)突變體，通過(guò)斑馬魚(yú)疾病模型進(jìn)行人類疾病研究和藥物篩選；

構(gòu)建含有特異性啟動(dòng)子的生物感應(yīng)器，用于環(huán)境監(jiān)測(cè)。

技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：

Tol2轉(zhuǎn)座子可攜帶大片段DNA；

Tol2轉(zhuǎn)座子沒(méi)有位置偏好性，幾乎能整合到染色體的任意位置；

Tol2轉(zhuǎn)座子的耐受范圍很廣；

Tol2作為天然的具有自主轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子，能夠在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)移；

Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠有效克服外源基因在后代傳遞頻率低的技術(shù)難題。

服務(wù)流程：

▲客戶提出轉(zhuǎn)基因品系制備需求；

▲分析可行性；

▲構(gòu)建載體；

▲斑馬魚(yú)胚胎注射；

▲founder篩選；

▲F1代斑馬魚(yú)養(yǎng)殖；

▲F2代斑馬魚(yú)養(yǎng)殖。

基因敲入技術(shù)

定義：非同源依賴的DNA修復(fù)技術(shù)，在斑馬魚(yú)基因組定點(diǎn)插入外源DNA片段（熒光蛋白、PA等）。

技術(shù)特點(diǎn)：定點(diǎn)插入。

服務(wù)流程：

▲根據(jù)客戶基因敲入要求進(jìn)行基因分析；

▲cas9 mRNA和多個(gè)gRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及合成；

▲高效gRNA靶點(diǎn)的篩選及效率驗(yàn)證；

▲敲入載體設(shè)計(jì)及構(gòu)建；

▲斑馬魚(yú)胚胎的顯微注射和敲入驗(yàn)證；

▲F0代斑馬魚(yú)的可遺傳性篩選；

▲雜合子F1代斑馬魚(yú)的基因型鑒定。

斑馬魚(yú)CRISPR基因編輯技術(shù)

敲入、敲除、轉(zhuǎn)基因……

快來(lái)與環(huán)特生物一起，

以斑馬魚(yú)生物科技

助力基因功能研究，

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