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【PNP】聚合物納米藥物載體使用多檢測器SEC分析的應(yīng)用案例
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納米藥物載體 熱點應(yīng)用
#本文由馬爾文帕納科GPC應(yīng)用專家馮慧慶供稿#
2022
PNP
聚合物納米藥物載體
納米藥物載體可實現(xiàn)靶向藥物治療。靶向給藥治療是指供助載體、配體或抗體將藥物通過局部給藥或全身血液循環(huán)而選擇性地定位于靶組織、靶器官、靶細胞或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)。在特定的導(dǎo)向機制作用下，納米藥物載體輸送藥物到特定靶點，發(fā)揮治療作用，可達到藥劑用量少、毒副作用低、藥效持續(xù)、生物利用度高、長時間保持靶目標(biāo)的有效藥物濃度的效果。
常見的納米藥物運載體系
在藥學(xué)研究中，正確定位小分子藥物的給藥位置和控制藥物釋放曲線是一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。通過小分子藥物與聚合物納米載體偶聯(lián)起來，在很大程度上實現(xiàn)細胞內(nèi)精準(zhǔn)靶向給藥，在實際應(yīng)用過程中有較好的效果。該方法既可用于控制藥物釋放曲線，又可用于控制藥物釋放位置，以最大限度地減少可能的副作用。
阿霉素（Doxorubicin）
阿霉素(Dox)是一種高效抗腫瘤抗生素，對肺癌、急慢性白血病等多種惡性腫瘤都有很強的細胞毒性，其機制是：通過將自身插入細胞的DNA堿基對中，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，阻斷DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄。通常是通過血液循環(huán)導(dǎo)入腫瘤細胞實現(xiàn)其抗腫瘤功能。
聚谷氨酸(PG)是一種以氨基酸谷氨酸為基礎(chǔ)的具有生物相容性的聚合物。試驗結(jié)果表明Dox和PG的偶聯(lián)，可以實現(xiàn)靶向給藥，提高藥物在靶體內(nèi)的聚集度，延長體內(nèi)循環(huán)時間，降低毒副作用。
在本文中我們展示了馬爾文帕納科OMNISEC多檢測器SEC如何對PG、Dox 和兩個PG-Dox 偶聯(lián)樣品進行表征。這種*的分析技術(shù)可用于研究藥物加載效率和藥物加載后發(fā)生的聚合物結(jié)構(gòu)變化。
研究方法
PG和PG-Dox偶聯(lián)物溶解在在pH7.4的PBS緩沖液中，通過OMINISEC進行樣品的分離和檢測。OMNISEC是一個多檢測器SEC系統(tǒng)，包括示差檢測器(RI)、紫外檢測器(UV)、光散射檢測器(LS)和粘度檢測器(IV)。流動相為PBS pH 7.4，含30%(v/v)甲醇水溶液；采用馬爾文A6000M和A3000色譜柱分離。
OMNISEC多檢測器SEC
檢測結(jié)果與討論
測試PG樣品和兩個PG-Dox偶聯(lián)物樣品色譜圖如圖1所示，PG的數(shù)值結(jié)果見表1。PG樣品分離顯示一個單峰，測得其平均分子量(MW)約為13KDa。再看兩個偶聯(lián)樣品，都分離出和PG具有相似保留體積的多峰。較早洗脫的光散射色譜圖(綠色，12-14mL)表明存在一些大的聚集體。而且，這些峰包含明顯的紫外吸收信號，表明Dox的存在成功地偶聯(lián)到聚合物上。
圖1 PG（A）、PG-Dox 1（B）和PG-Dox 2（C）多檢測器色譜圖
表1 PG測試結(jié)果
在圖2 A中可以看到，在不同進樣量下檢測游離Dox的UV色譜圖，可以看到游離的Dox從柱上洗脫得很晚，實際上已經(jīng)在整個柱體積之后。這清楚地表明了Dox與色譜柱發(fā)生了顯著的相互作用，延遲了Dox的洗脫。但從圖2 B所示濃度響應(yīng)曲線可以看出，盡管存在相互作用，回收率仍然接近100%。該校準(zhǔn)曲線用來測量存在于PG-Dox樣品中的Dox的量。
圖2 A：不同進樣量Dox在UV（490nm）色譜圖；B：Dox濃度校準(zhǔn)曲線
如果我們確定36mL處的峰為游離Dox，這樣PG-Dox樣品中的相同位置峰也能確定為游離Dox。如圖3所示，可以清楚地確定偶聯(lián)樣品含有PG-Dox偶聯(lián)物和游離Dox。
圖3 UV色譜圖顯示偶聯(lián)樣品含有PG-Dox偶聯(lián)物和游離Dox
使用圖2 B中的濃度校準(zhǔn)曲線，可以計算偶聯(lián)樣品中存在的Dox量。如表2所示，兩種PG-Dox偶聯(lián)物都含有游離的Dox。在一次注射體積中，PG-Dox 1的偶聯(lián)物中含有大約11μg的Dox，而PG-Dox 2的偶聯(lián)物中含有大約39μg的Dox。然后，可以計算出樣品中注入的總Dox質(zhì)量和Dox濃度。然后，可以根據(jù)溶解物質(zhì)的質(zhì)量計算出近似的總樣品濃度。這樣就可以計算每個PG-Dox偶聯(lián)物中Dox的近似負載量。由此可以近似地看出，樣品2的偶聯(lián)物中含有的Dox是樣品1的三倍。
表2 計算兩個偶聯(lián)樣品中Dox的負載量
我們可以對PG-Dox偶聯(lián)物進一步表征（其中dn/dc假設(shè)分析），計算偶聯(lián)聚合物的近似分子量、特性粘度和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，如表3所示。
表3 PG-Dox偶聯(lián)物測試結(jié)果
Mark-Houwink(M-H圖)顯示了特性粘度作為分子量的函數(shù)，是分子間結(jié)構(gòu)差異的直觀表示。在溶液中密度較高的聚合物在M-H圖上看起來較低，用來研究結(jié)構(gòu)變化，如支化、偶聯(lián)等結(jié)構(gòu)變化。圖4顯示了3個樣本的M-H圖。首先，這兩個PG-Dox偶聯(lián)物M-H曲線顯著低于單獨的PG。這是我們預(yù)料中的，因為藥物分子的偶聯(lián)將增加聚合物在溶液中的表觀密度，并且具有更大Dox負載量的樣品將進一步向下移動。PG-Dox 1和PG-Dox 2之間的斜率不同，說明Dox負載量可能不是隨分子量均勻分布的。
圖 4 Mark-Houwink曲線圖疊加顯示PG和PG-Dox偶聯(lián)物
結(jié)論
本文展示了如何將多檢測器SEC用于高分子聚合物偶聯(lián)小分子藥物傳遞表征分析的方法。在相同的測試條件下，對原聚合物、游離藥物(Dox)和兩種偶聯(lián)產(chǎn)物進行了表征。藥物的紫外吸光度使得可以測量負載水平和評估兩種偶聯(lián)物的偶聯(lián)水平。通過假設(shè)分析，偶聯(lián)分子量和結(jié)構(gòu)也可以測量并相互比較。
小分子藥物的輸送在實際應(yīng)用中面臨許多挑戰(zhàn)，與較大的聚合物偶聯(lián)是提高藥物定位和載藥量的一種策略，但要獲得可靠和可重復(fù)的結(jié)果，需要*的表征方法。通過使用OMNISEC這樣的多檢測器系統(tǒng)進行分析，研究人員可以更好地表征和研究，從而控制附著在聚合物納米輸送載體上的藥物量以及產(chǎn)品的分子量和結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)最佳的藥物輸送效率。