PCR擴(kuò)增的抑制劑有哪些？

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加，能將皮克(pg）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg）水平?？梢詮?00萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。所以無(wú)論是化石中的古生物，歷史人物的殘骸，還是案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)殘留的毛發(fā)皮膚或血液，都能用PCR加以放大進(jìn)行比對(duì)，這也是“微量證據(jù)"的威力所在。但是從各種生物檢材中提取的DNA，其中多含有能干擾PCR的抑制物，是DNA檢測(cè)失敗的重要原因之一。PCR抑制物的來(lái)源包括內(nèi)源性與外源性兩種。

1.內(nèi)源性

天然存在標(biāo)本中的組成成分。如：免疫球蛋白IgG、蛋白酶、血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物、血紅蛋白中的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、黏蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

2.外源性

外部引入的抑制物。如：腐殖酸化合物、肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。

常見的PCR抑制物有：

SDS:離子去污劑，0.01%即可完-全抑制PCR反應(yīng)，0.005%可顯著降低產(chǎn)量

苯酚:0.5%即可完-全抑制PCR反應(yīng)，0.2%可顯著降低產(chǎn)量

乙醇:大于1%的濃度可抑制PCR反應(yīng)，但在某些體系里又能增加產(chǎn)量

異丙醇:抑制作用比乙醇稍強(qiáng)

乙酸鈉:大于5mM時(shí)抑制PCR反應(yīng)

氯化鈉:大于25mM時(shí)抑制PCR反應(yīng)（生理鹽水無(wú)影響）

EDTA:0.5mM可使PCR產(chǎn)物減少，1mM完-全沒有PCR產(chǎn)物

血紅素（heme）-來(lái)源：血液，大于1mg/ml抑制PCR反應(yīng)

氯高鐵血紅素（hemin）：大于0.1ng/μl抑制PCR反應(yīng)

丹寧酸（tannic acids）：大于0.1ng/μl抑制PCR反應(yīng)

肝素：大于0.15IU/ml抑制PCR反應(yīng)

尿素-來(lái)源：尿，大于20mM時(shí)產(chǎn)生抑制

腐殖質(zhì)-來(lái)源：土壤，植物材料，自然界水

植物多糖-來(lái)源：糞便，植物多糖

聚苯乙烯，聚丙烯-來(lái)源：紫外線照射塑料管

膽酸鹽-來(lái)源：糞便

膠原質(zhì)-來(lái)源：組織

靛青染料-來(lái)源：粗斜紋棉布，牛仔褲

蛋白酶-來(lái)源：牛奶

鈣離子-來(lái)源：牛奶，骨頭

鐵離子-來(lái)源：血液

二甲苯胺

溴酚蘭

膽紅素（bilirubin）

PCR抑制物中大部分的作用機(jī)制尚不完-全清楚，但基本可以歸為以下幾種情況：

1.抑制 DNA 聚合酶的活性：有研究顯示，血紅蛋白、蛋白酶、尿素、多糖等物質(zhì)對(duì)PCR的影響，主要是通過對(duì)DNA聚合酶的抑制，使聚合酶降解、變性、活性區(qū)域失活，影響聚合酶與引物、模板結(jié)合。

2.阻礙樣本 DNA 模板與引物結(jié)合：腐殖酸化合物包含許多羧基和羥基，具有與 DNA 磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)相似的物理化學(xué)性質(zhì)，會(huì)影響模板 DNA 與引物的結(jié)合，阻礙鏈的延伸。

3.形成引物二聚體和使離子濃度改變:Mg2 + 是 DNA 聚合酶的激活劑，而標(biāo)本中的抑制物也會(huì)對(duì) Mg2 + 濃度產(chǎn)生影響，當(dāng) Mg2 + 濃度高達(dá) 0. 015mol /L 時(shí)，可降低擴(kuò)增的特異性，抑制 DNA 聚合酶。

4.干擾核酸提取過程中的細(xì)胞裂解：細(xì)胞裂解，核酸釋放使得核酸與酶作用產(chǎn)生擴(kuò)增。如果細(xì)胞裂解不完-全，核酸釋放不完-全，就不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增。

5.降解或包裹核酸：微生物如細(xì)菌產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶是一個(gè)降解DNA的因素。有些細(xì)菌的DNA酶屬于熱穩(wěn)定的核酸酶，在擴(kuò)增中期可水解基因組和引物DNA。核酸和引物也因?yàn)槠洳荒芘cDNA聚合酶結(jié)合而出現(xiàn)不擴(kuò)增。如蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞碎片、脂類等對(duì)PCR的抑制作用，很可能就是通過對(duì)DNA的物理包裹作用而使其不能與聚合酶接觸。

6.其他：乳膠手套上滑石粉對(duì)PCR擴(kuò)增影響可能會(huì)通過其對(duì)DNA的非特異結(jié)合作用進(jìn)行的，因?yàn)镈NA可結(jié)合至玻璃、二氧化硅等上，這也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。另外高血脂會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅，使得熒光信號(hào)強(qiáng)度降低。血液中高IgG 對(duì) PCR 反應(yīng)抑制機(jī)制是與單鏈 DNA 相互作用，使得靶 DNA 不能與 DNA 聚合酶相互作用，當(dāng)樣本加熱處理時(shí)，這種抑制作用會(huì)加強(qiáng)。

PCR抑制物的處理

了解了PCR抑制物之后，我們要如何減少這些抑制物對(duì)結(jié)果的影響呢？

1.去除PCR抑制物；

2.增加靶核酸濃度，使其能達(dá)到特定PCR的測(cè)定范圍；

3.增加樣本的均一性，以保證測(cè)定的精密度和重復(fù)性。

4.稀釋模板 DNA

5.添加 DNA 聚合酶

6.其 他：用氫氧化鈉處理 DNA 模板，添加交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、甜菜堿、硫酸胺鋁，采用離子交換柱分析技術(shù)、免疫分析技術(shù)、凝膠電泳分離技術(shù)、磁珠雜交捕獲技術(shù)等。