融解曲線中那些令你頭疼的問題

融解曲線中那些令你頭疼的問題，全面解析看這里！

我們在做染料法 SYBR Green qPCR時，除了要看擴增曲線的C_T值大小外，另一個重要的指標是融解曲線是否為單峰。那您知道融解曲線是怎么來的嗎？為什么說它是染料法 SYBR Green qPCR的重要指標之一呢？我們現(xiàn)在就來一起了解一下。

01，什么是融解曲線

要明確融解曲線的重要性，我們需要先知道染料法 SYBR Green qPCR的化學原理。

染料法 SYBR Green qPCR的體系中添加了一種DNA雙鏈小溝結合染料, 即SYBR Green。它與DNA結合時發(fā)光，游離時不發(fā)光，所以每形成一條DNA雙鏈，就會有一定數(shù)量的染料結合上去，就會產(chǎn)生熒光信號，信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比。

但是SYBR Green 只是識別DNA 雙鏈的小溝結構，當qPCR體系中存在非特異性產(chǎn)物時，SYBR Green 同樣可以和這些非特異性產(chǎn)物的DNA雙鏈結合發(fā)出熒光。所以儀器檢測到的熒光值其實為qPCR目的產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物熒光值的總和，那得到的C_T值自然是不準確的了。所以使用染料法qPCR，前提為qPCR擴增體系一定要特異。

qPCR擴增結束后，將溫度逐漸升高至95℃，DNA雙鏈也逐步解離為單鏈，DNA小溝結構逐步消失，SYBR Green 從雙鏈中游離出來，熒光值降低。當溫度達到 DNA 解鏈一半的溫度時，也就是 Tm 值時，SYBR Green 會大量游離出來，熒光強度隨之會出現(xiàn)突然下降，直至為0。這個反應熒光值變化的曲線即為融解曲線。

以ABI Q3軟件的融解曲線程序設置為例（參見上圖）：所有的DNA單鏈在60℃下全退火形成雙鏈后，溫度逐漸升高至95℃（升溫速度為0.15℃/sec），DNA雙鏈逐漸解鏈為單鏈。儀器檢測到該過程熒光信號的改變，即可得到融解曲線的熒光圖譜。

逐漸升溫至95℃過程中，雙鏈逐漸打開，熒光值高度下降

上圖為擴增曲線與融解曲線的原始圖譜，橫坐標代表循環(huán)數(shù)，縱坐標代表熒光值。前40個循環(huán)即為擴增曲線，40個循環(huán)之后為融解曲線?？梢?/span>看到隨著循環(huán)數(shù)增加，熒光值逐漸下降，當到達Tm值時，剩余雙鏈迅速解開，熒光值迅速降低至0。

但我們平時看到的融解曲線是下面的這張圖譜。它是由融解曲線原始圖譜上每個點取負倒數(shù)而得到的。其橫坐標表示溫度，波峰值對應的橫坐標的溫度值，即為Tm值。如我們圖中所示的融解曲線的Tm值為87℃。

02，融解曲線的作用是什么

融解曲線的Tm值是融解曲線中的重要參數(shù)，在使用同一qPCR試劑下，目標基因融解曲線的Tm值是由其產(chǎn)物長度與GC含量決定的。目標基因的qPCR產(chǎn)物長度越長、GC含量越高，Tm值越大。不同的qPCR產(chǎn)物因其長度與GC含量不同，它們的Tm值大小也不一樣。

如下圖所示，基因1 qPCR產(chǎn)物長度較基因2 qPCR產(chǎn)物短，那融解曲線表現(xiàn)出基因1的Tm值低于基因2的Tm值。

同理，如果qPCR擴增體系不特異，出現(xiàn)一個非特異性擴增產(chǎn)物，那qPCR產(chǎn)物即由目的產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物共同構成，因兩者長度與GC含量不同，在融解曲線上會表現(xiàn)出兩個Tm值，即兩個波峰；若非特異性產(chǎn)物Tm值與目的條帶的Tm值接近，融解曲線可能出現(xiàn)寬峰。