常見測蛋白濃度方法的優(yōu)缺點比較

蛋白濃度測定的方法有很多，但每種方法都有其特點和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎上根據不同情況選用恰當的方法，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結果精確，但操作復雜，用于大批量樣品的測試則不太合適；Lowry法精確度較高，但是比較費時，且每步的時間要求相對嚴格；Bradford法靈敏簡便，但易受去垢劑的影響；BCA法以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力強，結果穩(wěn)定，靈敏度高而受歡迎。在蛋白濃度測定中，以下面四種方法為常見：

1. Bradford法：

原理：在酸性環(huán)境中，蛋白質結合考馬斯亮藍G250染料，導致染料的吸收峰發(fā)生位移，從紅棕色形式（吸收峰 465nm）轉化為藍色形式（吸收峰 610nm）。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異most大，因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白復合物的藍色的best波長。結合到每個蛋白質分子上的考馬斯染料分子數大致與蛋白所帶正電荷的數量成正比，因此通過比色法可以測定溶液中蛋白質的含量。

優(yōu)點：

1. 靈敏度高，可以檢測到1μg/ml的蛋白質濃度。

2. 反應時間短，反應時間只需5-10分鐘。

3. 操作簡單，只需加入試劑，混合均勻即可。

4. 適用范圍廣，適用于大部分類型的蛋白質。

5. 不受溶液中還原劑的影響。

缺點：

1. 受干擾：某些離子和化合物會干擾測定結果，去垢劑（表面活性劑）會產生強烈干擾，使得與許多常用的緩沖液不兼容。

2. 靈敏度不穩(wěn)定：不同蛋白質的靈敏度不同，有些蛋白質可能無法被檢測到。肽或蛋白質的分子量必須大于 3,000 道爾頓才能被檢出。

3. 需要標準曲線：需要制備標準曲線來計算蛋白質濃度，增加了操作步驟。

近來市場上已出現能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒，可以兼容各種常用的蛋白緩沖液，大大拓展了應用范圍。

2. BCA法：

原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡合物，這種絡合物溶于水并在562nm處產生光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內與蛋白質含量呈近似線性關系，因此使用比色法可以對蛋白質進行檢測和定量。BCA法沒有反應終點，反應會隨著時間而持續(xù)進行；通過一段時間的孵育后，反應速度會變慢，從而可以對大量樣品進行檢測。
優(yōu)點：

1. 靈敏度高，可以檢測到低至0.5μg/mL的蛋白質。

2. 對蛋白質分子量沒有要求，小分子量肽也可檢測。

3. 結果穩(wěn)定可靠，重復性好。

4. 可用于高通量的蛋白質測定。

5. 與Bradford法相比，可耐受一定濃度的去垢劑。

缺點：

1. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM，DTT和巰基乙醇均低于1mM。

2. 對不同蛋白質的反應性不同，因此不同蛋白質靈敏度有差異。

3. 與Bradford法相比，操作相對較復雜，需要多個步驟。

3. Lowry法：

原理：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。通過比色法測定溶液中蛋白質的含量。

適合于測定20mg/L-400mg/L含量的蛋白質溶液，可檢測的蛋白質量低達5mg，通常測定范圍是20~250mg。

優(yōu)點：靈敏度高，可檢測低至1μg/mL的蛋白質；對于大部分蛋白質都有較好的線性關系。

缺點：

1.操作相對較復雜，需要多個步驟；

2.干擾物比較多，不僅還原劑和去垢劑會產生干擾，酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。

4. UV吸收法：

原理：利用蛋白質中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm處的吸收峰，測定溶液中蛋白質的含量。

優(yōu)點：操作簡單，無需添加試劑；可同時測定多個樣品。

缺點：靈敏度較低，只能檢測高濃度的蛋白質；對于某些蛋白質（如酶）會產生干擾，導致測定結果不準確。

5. 瓊脂糖凝膠電泳：

原理：通過比較待測樣品與已知濃度標準品的相對強度，估算待測樣品中蛋白質的含量。

優(yōu)點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度簡單易行，不需要昂貴的儀器設備。

2. 可以同時測定多個樣品的蛋白質濃度。

3. 可以測定不同分子量的蛋白質濃度。

缺點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度的準確性不如其他方法，誤差較大。

2. 測定時間較長，需要等待凝膠電泳完成。

3. 不能測定低濃度的蛋白質，因為測定靈敏度較低。