羥基磷灰石是一種無機純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，其球體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑較為均勻。羥基磷灰石與生物分子之間具有多種模式的相互作用，可同時實現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和兩種分離機制。陽離子交換主要依賴于羥基磷灰石上帶負(fù)電荷的磷酸基，同時，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通過金屬親和作用與羥基磷灰石上的鈣形成更強的結(jié)合。由于這些分離機制，使得羥基磷灰石成為當(dāng)今要求很高的下游工藝中重要的層析介質(zhì)，在抗體、疫苗(細(xì)菌多糖、肺炎多糖、病毒等)、核酸、酶和重組蛋白等生物制藥領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用?？梢杂糜谒拗鞯鞍?HCP)、脫落的ProteinA、抗體二聚體及聚合體、核酸及病毒的分離，經(jīng)常用于捕獲、粗純或精純各個純化階段。
百林科目前共有兩款羥基磷灰石層析介質(zhì)：BaronCHT type I和BaronCHT type II，兩種型號主要由不同燒灼溫度及時間生成，Ⅰ型為400℃、Ⅱ型為 700℃。目前上市的兩款CHT主要粒徑為40um。
圖1：百林科羥基磷灰石電鏡圖
CHT I型的蛋白載量比較高，適用于純化單、雙抗、重組蛋白等項目，且對酸性蛋白具有更高的載量。CHT II型載量較I型載量低，對核酸及某些蛋白具有更好的分辨率，適用于純化質(zhì)粒、mRNA等類型項目。CHT II型對白蛋白有低的親和力，更適合純化各類免疫球蛋白及其亞型。
羥基磷灰石因含有鈣和磷酸根存在，可穩(wěn)定的使用pH6.5-14溶液中,兼容以下試劑:
目前使用羥基磷灰石最主要的痛點有兩個：一是壽命，通常CHT壽命一般在40個Cycle左右，但是與具體的使用條件息息相關(guān)；二是該如何做工藝的優(yōu)化。
???影響CHT的壽命的常見因素
? 雜質(zhì)較多較粘稠的料液會嚴(yán)重影響填料壽命。
? 使用過程中PH環(huán)境長期暴露在 pH 6.5及以下酸性條件下降會造成CHT 的損壞導(dǎo)致減少 CHT 的使用次數(shù)。
? 羥基磷灰石使用時的所有緩沖液中均不能含檸檬酸或EDTA，這些整合劑會降解羥基磷灰石降低其使用壽命。
???提升CHT壽命的技巧
? 溶液中添加磷酸根或是鈣離子也可提升羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定維持其使用壽命及性能(鈣離子Ca2+會與磷酸根產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，添加量不宜超過2mM)。
? 在實驗時，洗脫前增加一個弱堿洗脫步驟能夠大幅提高柱子壽命，比如使用表面中和體系溶液(surface neutralization system，SNS)25mM Tris-HCl，25mM NaCl，5mM phosphate pH7.75運行 6-8CV。這種SNS溶液可以有效減少洗脫過程中的PH漂移程度和使用過程中層析柱反壓的升高，能有效地減少羥基磷灰石鈣離子的流失，以助于提升填料的壽命。
? 同時加入Arginie，lysine，histidine，PIPES，HEPES，MES，MOPS，的添加也能大幅度減低 CHT 中質(zhì)子釋放，使PH下降的幅度大大減少，減少了 CHT暴漏在低pH環(huán)境的時間而提高CHT 的使用次數(shù)。
圖2：在溶液中添加MES對于pH 漂移的影響
羥基磷灰石 使用原理及優(yōu)化策略
羥基磷灰石包括兩個結(jié)合位點：Ca和 PO4，這些結(jié)合位點按照其自有的晶體結(jié)構(gòu)分布。 PO4離子與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有陽離子交換特性；其中的Ca離子與帶負(fù)電蛋白質(zhì)的自由羧基簇以金屬鰲合方式結(jié)合。
不同的結(jié)合模式下的使用策略：
? 陽離子交換作用：當(dāng)?shù)鞍讕д姾蓵r候，可以與 PO4結(jié)合，而與Ca是相互排斥，這種作用主要是陽離子交換作用。這種陽離子交換作用會受到洗脫緩沖液中的中性鹽濃度 (如NaCl) 或者平衡液中磷酸鹽濃度的影響。這種作用隨著 pH 的增高也會相應(yīng)減弱。因此，增加鹽、磷酸鹽的濃度或增高 pH，都會減弱目的蛋白與PO4之間的相互作用。
? 鈣金屬鰲合作用：Ca可以與蛋白或其他分子(如核酸)表面的羧基簇或磷酸基團發(fā)生金屬整合作用，而同時與 PO4相排斥。這種結(jié)合方式作用力是一般離子交換的 15-60 倍。所以這種結(jié)合方式受離子的影響比較小，對 NaCl不敏感。而且這種作用力隨著離子強度會增加鈣金屬整合力，原因是由于離子強度的增加屏蔽了分子表面功能基團與 PO4之間的相互排斥作用。這種結(jié)合方式可以通過磷酸鈉進(jìn)行洗脫。
圖3：羥基磷灰石作用原理圖
因此，基于上述兩種作用機理，羥基磷灰石使用的常規(guī)緩沖溶液選擇一般為第一種：平衡液10mM PB PH6.8、洗脫液400mM PB PH6.8；第二種：平衡液10mM PB PH6.8、洗脫液10mM PB+1M NaCl PH6.8。
如果遇到結(jié)合弱，容易流穿，以及洗脫難度大，可以采用以下辦法：
1. 對于結(jié)合力較弱的樣品可以降低平衡液中磷酸鹽濃度提高結(jié)合能力。
2. 對于洗脫難度較大的樣品可以使用高濃度的磷酸鉀溶液進(jìn)行洗脫。
羥基磷灰石的常見再生方法：
a. 對于羥基磷灰石的再生一般使用500mM 中性磷酸鹽或磷酸鉀溶液或400mM 磷酸鈉清洗 3-5CV完成再生。
b. 也可以用包含 5mM 磷酸根的中性KCl，NaCl，6M 尿素或 8M 鹽酸胍清洗柱子。
c. 由于羥基磷灰石自身性質(zhì)具備很高的耐堿性，因此對其清潔消毒最高可以使用到2M NaOH(常規(guī)0.5M即可)，其保存溶液也可以直接選擇0.1~1M NaOH。如果要使用低于0.1M NaOH進(jìn)行保存，則需向保存液中添加10mM濃度的磷酸鹽。
羥基磷灰石的裝柱技巧：
1) 裝柱時，由于羥基磷灰石自身材質(zhì)的問題，不具有壓縮性。
2) 要使用流速裝柱而不要使用重力沉降裝柱。
3) 在裝柱過程中，剪切力很容易破壞顆粒，為了避免破壞，裝柱時候要選擇30%~50%的勻漿比，使用最小的力量輕輕的混合。
4) 對于40um CHT，一般使用10um 的篩板
5) 最終下沉柱頭時不要接觸到填料，當(dāng)柱子裝好后，要保持柱床穩(wěn)定。可參考百林科Baron CHT填料說明書中的裝柱步驟方法可獲得更好的裝柱幫助。
基于CHT的特殊的作用原理，通常它會帶來常規(guī)介質(zhì)不能達(dá)到的效果，也經(jīng)常被用于雙抗的純化，重組蛋白的純化以及一些多糖疫苗和重組因子類等產(chǎn)品的純化。
CASE 1 CHT 用于雙抗中進(jìn)一步提升純度
雙抗項目，用于去除聚集體實現(xiàn)更高的純度，SEC純度由95%提升至99%，回收率86%。
● 層析柱：4.7mL Baron CHTⅠ型預(yù)裝柱
● 上樣量：36.9mg/ml；線性流速120cm/h
● 平衡液：5mM PB PH6.8；
● 洗脫液：5mM PB+1M NaCl PH6.8
圖4：層析圖譜
圖5：HPLC 檢測圖
CASE 2 CHT 用于重組類因子的純化
CHT 用于重組類因子的純化，純度可達(dá)94%。某重組因子項目，與進(jìn)口友商進(jìn)行性能對比。
● 產(chǎn)品：BaronCHT Type I,40μm
圖6：百林科CHT I型與進(jìn)口友商性能對比
通過分析，收率、純度及質(zhì)量與進(jìn)口友商處于同一水平。
表1：百林科與進(jìn)口友商數(shù)據(jù)對比
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