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TonkBio無縫克隆試劑盒價格

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具體成交價以合同協(xié)議為準

公司名稱上海同科生物科技有限公司
品牌
型號
所在地上海市
廠商性質(zhì)生產(chǎn)廠家
更新時間2017/10/25 16:02:18
訪問次數(shù)1399

產(chǎn)品標簽:

無縫克隆試劑盒同源重組試劑盒重組克隆試劑盒

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上海同科生物科技有限公司成立于2007年，是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和技術(shù)服務(wù)于一體專注于生命醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的高科技企業(yè)。

同科生物注重創(chuàng)新研發(fā)，擁有市級工程技術(shù)研發(fā)中心，依托院士、國家千人計劃人才為導(dǎo)師顧問的高效的化研發(fā)團隊，使得公司的核心研發(fā)產(chǎn)品在生命研究及細分市場占據(jù)一定地位。

同科生物奉行可持續(xù)發(fā)展的原則，將社會責(zé)任納入到企業(yè)發(fā)展的*戰(zhàn)略中。在企業(yè)的經(jīng)營發(fā)展過程中，同科生物始終懷著感恩共享的心態(tài)，努力做一個讓社會、客戶、員工和股東滿意的企業(yè)。

內(nèi)外兼修、*致遠。面向未來，以“同科向前，何勝不有！” 為拼搏奮進的驅(qū)動力，不斷提高創(chuàng)新能力、服務(wù)能力以及整合能力，高效運營，以成為一家在生命領(lǐng)域里面提供*產(chǎn)品和服務(wù)的受人尊敬的企業(yè)。

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科研產(chǎn)品、生物試劑和生物技術(shù)服務(wù)等

產(chǎn)品簡介在線詢價

TonkBio無縫克隆試劑盒價格基于DNA序列同源性進行片段重組，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點。

TonkBio無縫克隆試劑盒價格產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：TonkBio無縫克隆試劑盒價格

英文名稱：Toneker Fast-Fusion Cloning Kit

TonkBio無縫克隆試劑盒價格規(guī)格：

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品價格
TB10012A	10 rxns	￥441
TB10012B	50 rxns	￥900

產(chǎn)品組成：

1、Fast-Fusion Enzyme

2、10× Fast-Fusion Buffer

產(chǎn)品簡介：

Toneclone無縫克隆試劑盒基于DNA序列同源性進行片段重組，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點。將載體在克隆位點進行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的**的序列 (15 bp～21 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，zui快僅需反應(yīng)5 min，即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價產(chǎn)品特點：

1、操作簡便：無需考慮酶切點限制；

2、快速重組：15min實現(xiàn)載體和片段的快速重組；

3、效率更高：重組效率為傳統(tǒng)酶切連接技術(shù)的5-10倍，無載體自連現(xiàn)象，陽性克隆可達90%以上。

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價產(chǎn)品應(yīng)用：

1、PCR產(chǎn)物克隆進載體

2、基因轉(zhuǎn)移

3、在插入片段前后插入adaptor、linker和標簽

4、高通量克隆

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價實驗方案

B．制備線性化載體

環(huán)形載體需要經(jīng)過線性化處理，使載體待重組區(qū)域暴露出來，以供與插入片段進行重組拼接。線性化的方法可以通過限制性內(nèi)切酶酶切或PCR方法實現(xiàn)。若采用酶切進行線性化處理，*進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收，以盡量避免為切割載體在轉(zhuǎn)化后造成假陽性結(jié)果。若PCR擴增得到線性化載體，*使用高保真聚合酶進行擴增，減少PCR體系中的模板用量以減少初始質(zhì)粒造成的假陽性，并在PCR結(jié)束后對產(chǎn)物進行切膠回收或使用DpnI酶消化殘余質(zhì)粒模板。

C. 插入片段的PCR引物設(shè)計

為了實現(xiàn)同源重組，插入片段擴增產(chǎn)物5’和3’末端需要帶有和線性化克隆載體兩個末端對應(yīng)的**的序列（15−21 bp）。下圖以pUC19作為克隆載體為例，設(shè)計引物：

	Forward Primer →
	15 bp tract (F) BamHI Gene-specific Primer
	5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC XXX XXX …-3’
Vecor pUC19 Clone site	5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G	AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’
	3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG	G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’
	3’-… XXX XXX CTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’
	Gene-specific Primer EcoRI 15 bp tract (R)
	← Reverse Primer

D. 插入片段的PCR擴增

插入片段可選用任何DNA聚合酶進行擴增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，產(chǎn)物末端的A尾在重組過程中將會被去除，不會因此產(chǎn)生單堿基插入突變。*使用高保真酶進行擴增，以減少在插入片段中引入突變。請在PCR完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，確認獲得單一條帶的DNA片段?？汕心z回收以除去模板、引物、引物二聚體?？赏ㄟ^與已知的DNA分子量marker比較，確定得到的DNA量。

E．重組反應(yīng)體系的建立以及反應(yīng)條件

在冰水浴中，配制如下反應(yīng)體系，將緩沖、水、線性化載體、插入片段加入PCR管中，輕彈混勻，zui后加入酶。

組成成分	用量
10× Fast-Fusion Buffer	1 μl
線性化載體	20−100 ng
插入片段	10−100 ng
ddH₂O	補加至10 μl
Fast-Fusion Enzyme	1 μl *

zui適線性化克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，可由下列公式粗略計算獲得：

Ø 線性化載體 = [0.01 × 線性化載體長度 (bp)] ng

Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段長度 (bp)] ng

例如將長度500 bp的插入片段克隆到長度2.7 kb的pUC19中，克隆載體的zui適使用量為：0.01×2700=27 ng，插入片段的zui適使用量為：0.02×500=10 ng。

注意：1. 當插入片段大于克隆載體時，兩者計算用量公式應(yīng)互換。

2. 線性化載體用量應(yīng)在20−100 ng之間，插入片段擴增產(chǎn)物用量應(yīng)在10−100 ng之間。當使用上述公式計算DNA用量超出這個范圍是，請直接選擇zui低/zui高使用量即可。例如插入片段200 bp，zui適用量計算值為4 ng，實際反應(yīng)體系中應(yīng)加入10 ng。

反應(yīng)體系配制完成后，輕彈混勻，并通過短暫離心使其沉到管底，立即放入已預(yù)熱的PCR儀或平衡至所需溫度的水浴中。按下表中方案選其一進行。*在PCR儀中進行反應(yīng)，60°C，15 min。（若選擇在37°C水浴反應(yīng)，請在10 μl反應(yīng)中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻10 min，然后直接轉(zhuǎn)化。也可選擇−20°C儲存，待需要時，冰上解凍并轉(zhuǎn)化。

PCR熱循環(huán)儀		水浴
70°C, 5 min	60°C, 15 min	37°C, 15 min
4°C, ∞	4°C, ∞	冰水浴

F．轉(zhuǎn)化

*使用轉(zhuǎn)化效率≥10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細胞，按照對應(yīng)的說明書操作。若轉(zhuǎn)化效率低于10⁸ cfu/μg，可在凃布前將培養(yǎng)的菌液在6000 rpm離心5 min，沉菌用100 μl培養(yǎng)基重懸后，全部涂于對應(yīng)抗性的平板上。過夜培養(yǎng)后，形成數(shù)百個單克隆，可根據(jù)需要選擇PCR或酶切鑒定是否為陽性。

G．常見問題與解決方案

問題	可能的原因	解決方案
平板上無克隆或克隆數(shù)目很少	引物序列不正確	l 確認引物序列含有15 bp與載體插入?yún)^(qū)域**的同源序列。
	PCR產(chǎn)物不純	l 優(yōu)化PCR擴增反應(yīng)以得到單一PCR產(chǎn)物。 l 換一種純化方法，純化您的PCR產(chǎn)物。
	反應(yīng)體系中DNA濃度太低	l 在重組反應(yīng)中，加入*的DNA量。
	不純的載體或插入片段抑制重組反應(yīng)	l *采用膠回收或離心柱法純化DNA后進行重組反應(yīng)。
	轉(zhuǎn)化過程中加入重組反應(yīng)液過多	l 重組反應(yīng)液的轉(zhuǎn)化體積不應(yīng)超過轉(zhuǎn)化細胞體積的1/10。
	感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率低	l 更換新鮮、高效的感受態(tài)細胞。
	培養(yǎng)基中加入錯誤或過多抗生素	l 在轉(zhuǎn)化平板中加入正確、適量的抗生素。
假陽性克隆數(shù)目多	克隆載體線性化不*	l 重新酶切您的載體，增加酶切時間，并膠回收純化。
	PCR使用的模板質(zhì)?？剐耘c所需克隆載體抗性相同造成的污染	l 可在PCR反應(yīng)之前先將模板質(zhì)粒線性化。 l PCR產(chǎn)物用DpnI處理，消化模板質(zhì)粒，然后再純化。
	轉(zhuǎn)化用平板放置時間過長導(dǎo)致抗性失效	l 確認平板新鮮配置，并含有正確、適量的抗生素。
克隆含有不正確的插入片段	PCR產(chǎn)物混有非特異性片段	l 優(yōu)化PCR擴增體系，提高特異性或膠回收純化目的片段。