體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒,選用轉化和篩選技術,可獲得含重組的陽性克隆.

實驗原理：
    體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒,選用轉化和篩選技術,可獲得含重組的陽性克隆.在此陽性克隆中, DNA 可在生物體系中大量擴增,繁殖,保存以及表達目的基因的產(chǎn)物,這是PCR體外擴增DNA所不能替代的.配合DNA重組技術,所獲得的,不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研,醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領域.
    質粒 轉化不同 細菌 有不同的轉化效率,轉化效率的高低與實驗的成敗直接相關, 通常轉化效率可達105－107轉化子/μg DNA.獲得高轉化效率的關鍵是感受態(tài)體菌的制備.感受態(tài)就是細菌吸收轉化因子的生理狀態(tài),只有發(fā)展為感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定攝取外來的DNA分子. pUC18的LacZ基因區(qū)域當有DNA片段插入時,LacZ基因失活,轉化進入 大腸桿菌 并在含有IPTG和X-gal培養(yǎng)基生長時,會產(chǎn)生白色的克隆,不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落.
DNA分子轉化分以下幾步：
1、 吸附-- 雙鏈DNA 分子吸附于受體菌表面；
2、 轉入--雙鏈DNA分子解鏈.一條鏈進入受體菌,另一條降解；
3、 自穩(wěn)--外源質粒DNA分子在細胞內(nèi)復制成雙鏈；
4、 表達一供體基因隨同復制子同時復制,分裂, 轉錄翻譯.

實驗試劑：
LB培養(yǎng)基
      質粒DNA（含Amp抗生基因）,受體菌
      CaCl2 0.1M
      Amp

實驗過程：
1、 感受態(tài)細胞 制備及CaCl2處理：
1) 將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,37℃培養(yǎng)16～20小時.
2) 挑取單菌落轉入20mL LB培養(yǎng)基錐瓶中,37℃振蕩過夜.
3) 從中取2mL菌液轉入50mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)4－5小時,測OD100達0.4～0.5.
4) 培養(yǎng)物于冰上10分鐘.
5) 轉入－50mL 離心管 ,于4000rpm下4℃離心10分鐘.
6) 棄上清,倒置離心管1分鐘,流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分鐘.
7) 4,000rpm 4℃離心10分鐘,棄上清.
8) 加入2ml,0.1M CaCl2懸浮細胞,于4℃過夜.