啤酒作為一種性飲料，幾百年來(lái)一直被認(rèn)為是一種安全的飲料，因?yàn)樗奶厥馍a(chǎn)環(huán)境很大程度上限制了許多微生物在啤酒中的生長(zhǎng)，如高CO2、低氧、低pH、營(yíng)養(yǎng)成分少，而且還有一定量的乙醇和產(chǎn)生苦味的酒花物質(zhì)。特別是啤酒花能對(duì)絕大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用。因此控制抗酒花物質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌也就成為控制啤酒*菌的關(guān)鍵。這些抗酒花的革蘭氏陽(yáng)性菌大多數(shù)是一些乳酸菌。目前，對(duì)這些*菌的檢測(cè)主要還是通過(guò)從啤酒中分離出*菌在平板上厭氧培養(yǎng)，然后通過(guò)觀察和一些生理生化試驗(yàn)來(lái)判定這些*菌。這種方法zui大的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，5～7 d才可以看到結(jié)果，不能及時(shí)反饋啤酒中微生物污染情況，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有很大的滯后性。PCR技術(shù)從分子、基因水平極大地提高了檢測(cè)效率，具有方便、快捷、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)[1～5]。目前，美國(guó)、日本、加拿大和我國(guó)的科研工作者都致力于將PCR技術(shù)應(yīng)用于啤酒*菌的鑒定和檢測(cè)。
    1　傳統(tǒng)檢測(cè)方法的原理和缺點(diǎn)
    1.1　傳統(tǒng)檢測(cè)方法的原理
    目前，啤酒*菌的檢測(cè)，特別是啤酒生產(chǎn)企業(yè)，大多數(shù)在人工制作培養(yǎng)基上培養(yǎng)。其原理是根據(jù)不同*菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分、zui適溫度、zui適pH，在其適宜的溫度下培養(yǎng)，然后根據(jù)不同菌落、細(xì)胞特征及一些生理生化特征的鑒定來(lái)確定*菌的類(lèi)型。理論上只要在啤酒中有一個(gè)*菌的細(xì)胞，就能在適宜的溫度、培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)繁殖。然后通過(guò)菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性以及一系列生理生化實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定這些*菌。
    1.2　傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)
    盡管目前許多企業(yè)仍然在用傳統(tǒng)方法檢測(cè)啤酒中的*菌，但傳統(tǒng)檢測(cè)方法有以下幾方面的不足。
    1.2.1　檢測(cè)所需要時(shí)間長(zhǎng)：一般的*菌檢測(cè)至少需要2～5 d，甚至7 d以上。檢驗(yàn)結(jié)果出來(lái)時(shí)往往產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，具有嚴(yán)重的滯后性。
    1.2.2　操作繁瑣，自動(dòng)化程度不高：傳統(tǒng)的檢測(cè)方法往往需要花費(fèi)大量的人力。適合不同*菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基以及不同*菌適宜生長(zhǎng)的pH、溫度等都需要花費(fèi)一定的人力和時(shí)間，觀察菌落特征、細(xì)胞特征、革蘭氏染色以及生理生化鑒定等步驟較繁瑣。而且，研究表明[6]，沒(méi)有一種培養(yǎng)基適合所有的啤酒*菌生長(zhǎng)。
    1.2.3　檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確：啤酒*菌包括一些乳酸菌、醋酸菌和野生酵母等，特別是一部分乳酸菌具有酒花抗性，它們是zui重要的啤酒*菌。幾乎所有的乳酸菌都能在啤酒中生長(zhǎng)，但只有一部分乳酸菌才能使啤酒*變質(zhì)。所以用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不能真正準(zhǔn)確地檢測(cè)出啤酒的*菌。
    2　PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌的原理和特點(diǎn)
    PCR技術(shù)是由Kleppe等人在1971年首先提出的。它是通過(guò)對(duì)人工耗時(shí)長(zhǎng)或難以培養(yǎng)的微生物的DNA或RNA片斷的擴(kuò)增來(lái)對(duì)啤酒中的*菌的檢測(cè)的。首先通過(guò)高溫變性、低溫退火、適溫延伸完成對(duì)目的基因的擴(kuò)增階段，然后將PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂凝膠電泳分析。整個(gè)過(guò)程可在1 h內(nèi)完成[1]。而且從理論上講，只要啤酒中含有一分子的*菌的DNA或RNA片段，即可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增并檢測(cè)到。所以，PCR檢測(cè)技術(shù)在啤酒*菌的檢測(cè)中顯示出其他方法*的優(yōu)點(diǎn)——快速、便捷、準(zhǔn)確。 
    根據(jù)PCR擴(kuò)增使用的引物不同。用PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒中*菌的方法大體可歸為3種類(lèi)型：使用特異性引物的PCR檢測(cè)方法；使用任意引物的PCR檢測(cè)方法；使用嵌套式引物的PCR檢測(cè)方法[1]。
    3　用特異性引物的PCR檢測(cè)方法
    3.1　根據(jù)抗酒花基因horA設(shè)計(jì)特異性引物
    盡管啤酒中的許多成分對(duì)微生物造成很大的抑制作用，但一些微生物（主要是一些乳酸菌）卻仍然能在啤酒中生長(zhǎng)繁殖，并使啤酒產(chǎn)生渾濁、沉淀、異味和雙乙酰等*現(xiàn)象[4]。有趣的是這些對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用的酒花物質(zhì)（主要是異-α-酸）對(duì)這些乳酸菌卻無(wú)濟(jì)于事。因此，許多學(xué)者都致力于抗酒花機(jī)理和基因的研究。日本的學(xué)者從抗酒花菌株短乳桿菌ABBC45的質(zhì)粒上鑒定得到抗酒花基因horA，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)能引起啤酒*的乳桿菌均含有似horA的基因[1]。1997年，Manabu Sami等[7]還發(fā)現(xiàn)啤酒*菌中這些含有抗酒花基因的質(zhì)?？截悢?shù)與酒花抗性大小的增減性是一致的，這說(shuō)明horA基因與酒花抗性有關(guān)。東京大學(xué)、加利福尼亞大學(xué)的研究者通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)一系列乳桿菌的horA基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，已成功地從啤酒中對(duì)乳桿菌、干酪乳桿菌、胚芽乳桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，且準(zhǔn)確性高，整個(gè)horA-PCR檢測(cè)過(guò)程大約需6 h，比傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法要快得多[1，2，7，8]。
    3.2　根據(jù)其他一些與酒花抗性有關(guān)的基因設(shè)計(jì)引物
    K.suzuki等[7]對(duì)啤酒*菌的研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)*喪失*能力的短乳桿菌ABBC45CC（是經(jīng)過(guò)短乳桿菌ABBC45C次級(jí)培養(yǎng)獲得的）分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒PRH45Ⅱ在短乳桿菌ABBC45CC中丟失，隨后通過(guò)對(duì)質(zhì)粒PRH45Ⅱ上的不同區(qū)域的片段進(jìn)行切除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒*菌缺少ORF5的比率相當(dāng)高，所以通過(guò)對(duì)OFRF5的序列設(shè)計(jì)引物來(lái)進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌也取得了一定效果。zui近Koji Suzuki和T.Fujii[9]通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，一些含有horA基因的乳桿菌也并不具有*能力，而且他們發(fā)現(xiàn)丟失horA基因的L.brevisABBC45-L.brevisABBC45C仍然有一定的*能力。因此，他們認(rèn)為抗酒花機(jī)制是由多重基因控制決定的。Koji Suzuki對(duì)51株啤酒*菌研究，還發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)基因horB和horC與酒花抗性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)horB/horC基因的擴(kuò)增能檢出其中的49株*菌，且無(wú)假陽(yáng)性的檢出。因此，他們認(rèn)為PCR技術(shù)檢測(cè)通過(guò)結(jié)合horA、horB/horC基因能大大提高啤酒中*菌的檢測(cè)，同時(shí)可避免由horA引起的假陽(yáng)性現(xiàn)象[1，2，7，9]。

3.3　根據(jù)分類(lèi)鑒定法設(shè)計(jì)特異性引物
    啤酒中*菌主要是乳酸菌，其中主要包括短乳桿菌、有害片球菌、林氏乳桿菌等，短乳桿菌、有害片球菌是啤酒很有名的*菌，而林氏乳桿菌是到目前為止發(fā)現(xiàn)的所有菌株都是啤酒*菌[10]。因此，有人用分類(lèi)鑒定的核糖體RNA上的基因序列來(lái)檢測(cè)啤酒中的這些*菌。加拿大Labatt公司的研究人員在啤酒*菌的乳酸菌的檢測(cè)中使用5S和16SRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于菌種的特性鑒定。已成功地對(duì)乳桿菌、片球菌、明膜串珠菌屬中的菌株做出鑒定。日本的研究者為了提高PCR分析的靈敏度和特異性，根據(jù)16SrRNA和23SrRNA之間的間隔區(qū)的特異性序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用于啤酒*菌的PCR檢測(cè)。這種方法比較快捷、方便，但有時(shí)難以將種內(nèi)一些*菌和非*菌區(qū)分開(kāi)[1，11]。
    3.4　利用任意引物的PCR檢測(cè)方法（RAPD-PCR）
    RAPD-PCR是使用較短的寡核苷酸引物擴(kuò)增一群長(zhǎng)度不等的DNA片段混合物，這些產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出的帶型，反映了用于擴(kuò)增模板的DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征，所以能夠測(cè)出2個(gè)生物體（包括同一物種的不同個(gè)體）基因之間的差異。親緣關(guān)系越近的種，PCR擴(kuò)增帶型就越相似，反之差異懸殊[12]。
    使用RAPD-PCR技術(shù)，所需DNA提取物少，在10 h內(nèi)能檢測(cè)出啤酒污染的結(jié)果，每一種引物能產(chǎn)生*的特異性指紋圖譜，將其對(duì)照便得到鑒定結(jié)果，加拿大LABATT公司的研究人員運(yùn)用此技術(shù)鑒別啤酒*細(xì)菌的種和亞種[1，12]。
    3.5　利用嵌套式引物的PCR檢測(cè)方法（Nest-PCR）
    Nest-PCR是利用*輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的起始原料，除使用*輪的一對(duì)特異性引物外，還加一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)處在前2個(gè)引物之間的新引物。
    啤酒中含有大量的酵母，因此用PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒中*菌時(shí)，酵母會(huì)對(duì)其形成一定的干擾。使用普通的PCR檢測(cè)*菌時(shí)，酵母細(xì)胞的存在如果大于3×104時(shí)，就會(huì)干擾細(xì)菌的鑒定。如果對(duì)樣品進(jìn)行稀釋來(lái)降低酵母的干擾，但同樣也會(huì)降低檢測(cè)水平。而使用Nest-PCR檢測(cè)*菌時(shí)，由于*輪反應(yīng)之后增加了靶模板數(shù)量，使第二輪反應(yīng)的效率明顯提高；由于*輪反應(yīng)產(chǎn)物比*輪反應(yīng)的模板DNA小，所以在第二輪反應(yīng)過(guò)程DNA變性時(shí)間縮短，也使得反應(yīng)速度加快[1]。
    加拿大Labatt公司的研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定和檢測(cè)用于乳酸菌鑒定的Nest-PCR的引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)酵母和細(xì)菌細(xì)胞之比為1.6×104∶1時(shí)，凝膠電泳清晰可見(jiàn)[2]。因此，Nest-PCR技術(shù)提高了在高濃度酵母細(xì)胞存在下檢測(cè)乳酸菌的靈敏性，使用此技術(shù)可鑒定一定濃度的酵母發(fā)酵液中含有的微量污染菌，且僅需要8 h即可完成。
    Nest-PCR技術(shù)使在發(fā)酵結(jié)束和酵母回收前24 h內(nèi)完成對(duì)污染菌的檢測(cè)分析成為可能，從而確保了啤酒生產(chǎn)中微生物的控制。
    因此，Nest-PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌能提高檢測(cè)效率，特別是對(duì)含有高濃度酵母細(xì)胞的樣品的檢測(cè)。
    4　PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌的發(fā)展趨向
    隨著分子生物學(xué)、光學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌也越來(lái)越趨向于同其他技術(shù)緊密結(jié)合應(yīng)用。
    4.1　取樣
    在取樣階段，研究者發(fā)現(xiàn)，啤酒中高濃度物質(zhì)的存在對(duì)PCR的靈敏度也有一定的影響。當(dāng)利用膜過(guò)濾啤酒富集乳酸菌用于檢測(cè)時(shí)，實(shí)際靈敏度也隨過(guò)濾啤酒體積增加而降低。而不同啤酒的抑制因子也有所不同。日本學(xué)者通過(guò)在特異性引物的PCR實(shí)驗(yàn)（L.lindner）中發(fā)現(xiàn)使用水樣檢出限（63 cfu）比啤酒的檢出限（9 cfu）明顯低，這說(shuō)明啤酒中存在一些抑制因子[1]。
    Di Michele和Le Wis進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用纖維素酯膜過(guò)濾，在丙酮酸中溶解，積累于膜上的PCR抑制因子并沒(méi)有除去；采用聚碳酸酯膜，用十六烷基*基溴化銨溶液提取，僅適用一些含菌量高的樣品；用聚碳酸酯膜過(guò)濾，將膜溶于四氯化碳-異戊醇，再轉(zhuǎn)入Eppendorf管中加水、離心沉淀、取上清液、再加水離心沉淀處理后靈敏度大大提高。日本的學(xué)者也用了類(lèi)似的方法提高了檢測(cè)限度[1，2]。
    4.2　引物使用
    在使用引物方面，目前盡管研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從L.brevisABBC45的大小為15.1 kb的質(zhì)粒pRH45上分離得到的horA基因與細(xì)菌的抗酒花作用有很大的關(guān)系。但也有一些實(shí)驗(yàn)表明，丟失含有horA基因的質(zhì)粒pRH45的L.brevisABBC45C 仍然有一定的抗酒花性，這說(shuō)明抗酒花還可能存在其他基因控制[9]。特別是在對(duì)抗酒花菌株質(zhì)粒ORF上的一些核苷酸序列的研究表明[11]（ORF5研究比較深入）其也與抗酒性有很大關(guān)系。因此，PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒中*菌的設(shè)計(jì)引物要從單一的特異性引物向多種特異性引物發(fā)展。
    4.3　其他方面
    PCR技術(shù)和其他學(xué)科越來(lái)越緊密，如酶聯(lián)免疫PCR（PCR-ELISA）法檢測(cè)，以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展使得PCR檢測(cè)技術(shù)的自動(dòng)化程度越來(lái)越高，抗酒花機(jī)理的研究進(jìn)一步清晰，標(biāo)志性基因更有代表性，使得檢測(cè)效率也越來(lái)越高[13，14]。
    用傳統(tǒng)的方法來(lái)檢測(cè)啤酒中的*菌存在許多問(wèn)題。因?yàn)槠【?菌畢竟是一種弱勢(shì)菌，分離困難，特別是在其污染程度極低的情況下，且*菌活力較低，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法就很難檢測(cè)到。另外，用選擇性培養(yǎng)基分離*菌要抑制啤酒中大量生長(zhǎng)的酵母，常在培養(yǎng)基中加有毒的放線菌酮，這樣會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成一定的危害?，F(xiàn)代啤酒工業(yè)的發(fā)展，好氧污染菌已經(jīng)不是問(wèn)題了，主要的*菌是兼性厭氧和厭氧菌，厭氧菌的培養(yǎng)更加增加了培養(yǎng)工作的繁瑣。特別是在污染菌細(xì)胞數(shù)目極其少的情況下，用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法就很難檢測(cè)到。隨著一些如膜過(guò)濾等快速集菌方法的發(fā)展，PCR模板獲得的方法（常規(guī)法，凍融法，煮沸法）的方便，使得PCR技術(shù)對(duì)啤酒*菌檢測(cè)，能在更短的時(shí)間內(nèi)得到更低的檢出限。田小群等人的研究表明，PCR技術(shù)對(duì)啤酒中的短乳桿菌的zui低檢出限可達(dá)到3個(gè)細(xì)胞[5]。
    當(dāng)然PCR技術(shù)檢測(cè)啤酒*菌還存在一些問(wèn)題，由于啤酒釀造過(guò)程中不同的環(huán)境使得各階段*菌的種類(lèi)和數(shù)量有所不同，所以目前常用DNA序列的PCR技術(shù)檢測(cè)并不能知道檢測(cè)到的DNA片段是來(lái)自活細(xì)胞還是死細(xì)胞；而且絕大多數(shù)是PCR技術(shù)局限于對(duì)那些核苷酸序列清楚的微生物的檢測(cè)；在定性檢測(cè)的同時(shí)定量檢測(cè)還顯得有點(diǎn)不足。我們相信在不久的將來(lái)啤酒*菌的定量檢測(cè)也會(huì)實(shí)現(xiàn)。