超全熒光定量PCR應(yīng)用常見問(wèn)題匯總！

20世界90年代由美國(guó)Applied Biosystems公司推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time qPCR），其基本原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光染料探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程。熒光定量PCR最大的優(yōu)勢(shì)可以對(duì)初始模板進(jìn)行定量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一旦遇到?jīng)]有Ct值情況，就要在第一時(shí)間排查是否有以下問(wèn)題：

在相對(duì)定量中，Ct值一般控制在15~25之間比較好，如果在絕對(duì)定量中，對(duì)低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會(huì)增大，但是一般不宜超過(guò)40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確。因此，判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

如果遇到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R²<0.9）的情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣存在誤差，吸樣不準(zhǔn)，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；

（2）標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，不要反復(fù)凍融，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針；

（4）模板中存在抑制物。模板濃度過(guò)高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量不超過(guò)500ng，以50~500ng為宜。

如果陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào)，首先排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

（2）引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

（3）鎂離子濃度過(guò)高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。

（4）模板有基因組的污染。RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。

（5）交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

如果熔解曲線峰不特異，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，這是最主要因素；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時(shí)，適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；

（2）離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合，有些情況下可以通過(guò)更換試劑盒改善結(jié)果；

（3）模板有基因組污染。RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。

該情況適用于針對(duì)所有的基因，特別是內(nèi)參基因仍無(wú)法獲得較好的擴(kuò)增信號(hào)時(shí)，應(yīng)考慮如下情況：

（1）反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；

（2）反應(yīng)條件不夠優(yōu)化?？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法，適當(dāng)延長(zhǎng)變性退火時(shí)間；

（3）反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入的，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。

如果遇到擴(kuò)增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

參考文獻(xiàn)：

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits （EUROGENTEC）