各種層析方法層出不窮，令廣大生物工藝工程師們眼花繚亂。本文將就如何選擇層析方法提供相關指導，幫助用戶選擇更適合您應用的層析介質。
進行層析操作時，用戶往往需要做出一系列重要決策。即使僅有一種層析介質(如傳統(tǒng)填料)，用戶也可采用多種不同類型的層析填料將寶貴的目標產物與污染物和雜質分離開來。更何況目前已有多種層析介質類型可選。用戶面臨的選擇愈發(fā)多樣，搭配靈活性也不斷提升，要選出適合相關應用的最佳組合十分困難。
盡管很具挑戰(zhàn)性，但我們仍可借助大量數(shù)據(jù)和信息做出符合科學原理和科學證據(jù)的決定。之前，我們探討過了解目標產物和需要去除雜質的特性至關重要，并介紹了電荷、疏水性和配體結合親和力等特性對分離效果的影響。我們可以利用這些特性來選擇適合相關應用的層析方式，但不同的層析介質之間又該如何選擇呢？
目前共有三種層析介質可供選擇，用戶很可能已對其中一種十分了解。這種了解和過往使用經驗對決策影響巨大，往往能夠表明用戶使用該介質時已經獲得長期成功和穩(wěn)健工藝，經得起時間的考驗。但當新機會出現(xiàn)時，明智之舉是重新審視層析流程，并確認新產品是否足夠出色，值得我們重新審視流程甚至替換舊產品。
在此，我們將詳細介紹以下三種層析介質的不同特性：整體柱、傳統(tǒng)填料和膜層析。希望大家能夠從中掌握所需信息，在完全知情的情況下做出決策。
樹 脂
樹脂可以說是經典的層析介質，是檢驗新型層析介質的有用基準。盡管已問世多年，但層析填料仍然是目前眾多分離工藝中的重要工具。
圖 1——樹脂層析法利用填裝進層析柱中的小顆粒樹脂進行分離。小顆粒樹脂具有特殊的化學特性，可為目標分子(藍綠色)或雜質(粉色)提供結合位點(黃色)。
也正由于傳統(tǒng)樹脂填料已經上市相當長時間，因此市面上生產廠家眾多，產品也極其多樣。其主干結構可由不同材料制成，也可適用于不同分離模式——離子交換層析(IEX)、親和層析(AC)、疏水層析(HIC)和混合模式層析(MMC)常常都會用到樹脂。用戶可購買散裝樹脂，再小心將其填充進合適尺寸和規(guī)格的層析柱中，最后根據(jù)樹脂特性用其分離不同的生物分子。用戶也可購買預填充的即用型層析柱，廣泛適用于從小型分析儀至中等規(guī)模生產運行等不同規(guī)模。
填料顆粒的關鍵特征之一是包含微孔結構，結合位點便位于其中。這意味著溶質分子必須由液相擴散進微孔中，才能發(fā)生結合。這一過程會降低分離速度，因為分子擴散總會受到限制，而且有效擴散需要在低流速下才能實現(xiàn)。
同時，微孔尺寸較小，無法結合非常大的分子和大顆粒。就大多數(shù)樹脂而言，如分子大小超過 IgM(如 mRNA、質粒 DNA、病毒載體和外泌體等)，則只能擴散進一小部分微孔中的結合位點。而小于單克隆抗體的任何分子，其最大結合載量往往很高。
時至今日，傳統(tǒng)填料已經成為應用最為廣泛的生物分子純化基質，涵蓋從實驗室到重大新藥級生產的各種規(guī)模。其在單克隆抗體純化等眾多生物工藝中的應用已相當成熟。
整 體 柱
整體柱相對較新，其特點與傳統(tǒng)填料區(qū)別顯著。整體柱是由一整塊聚合物制成的空心圓柱體，中間布滿相互連接的通道。進行層析的官能團分布在互連通道的壁表面。與樹脂不同，整體柱沒有微孔結構，意味著質量傳遞不會受到擴散限制。相反，大量洗脫液可以攜帶待分離的分子、顆?；蚰遗萘鹘浲ǖ?，而質量傳遞僅通過對流實現(xiàn)。
圖 2——整體柱層析法利用包含大量互連通道的整體結構進行分離?；ミB通道可為目標分子(藍綠色)或雜質(粉色)提供結合位點(黃色)。
目標分子過大是考慮使用整體柱的首要因素之一，因為使用樹脂層析大分子會導致擴散速度過慢，甚至無法進入填料顆粒的微孔中。而使用整體柱層析大分子則會大幅提高吸附效率，形成陡峭的流穿曲線并實現(xiàn)較高的結合載量。
整體柱層析與通過基質的流速無關，分離速度通常較樹脂顯著提高，有利于加快工藝速度并提高生產效率。不僅如此，整體柱也可用于快速去除腐蝕性雜質，此類雜質如與目標分子接觸過久則可能破壞目標分子。
整體柱的另一大有用特性是通過層析床的流動方式主要為層流，可為對剪切應力特別敏感的 mRNA 等分子提供更加溫和的層析條件。整體柱中的層流與層析填料填充床中的湍流形成鮮明對比。湍流，尤其是在高流速下形成的湍流，會產生強大的剪切力，從而破壞對剪切力敏感的分子。
除此之外，整體柱層析由于背壓較低，特別適合分離高粘性原料。隨著強化工藝的趨勢日益流行，這一優(yōu)勢會變得越來越有價值。
整體柱適用于多種層析方法，包括 IEX、AC(如搭配 oligo dT 配)、HIC 和 MMC。產品通過即買即用型整體交付，大小不等，適用于研發(fā)實驗室和生產。
膜 層 析
膜層析使用多層多孔膜進行分離，結合位點位于膜孔內。排列在膜堆中的膜孔攜帶流動相，即質量傳遞為對流方式。
圖 3——膜層析法依靠多孔膜堆疊實現(xiàn)。膜孔中包含目標分子(藍綠色)或雜質(粉色)的結合位點(黃色)。
膜層析的特點是速度快。膜堆厚度可選，以切實優(yōu)化并實現(xiàn)快速分離。使用膜層析可以高流速實現(xiàn)大量進料。
除此之外，由于膜結構中的結合位點分布廣泛且易于進入，因此膜層析法的分離效率十分出色。而對流傳質也不會因擴散緩慢而形成時間限制。
快速分離對暴露于酶分解或其他破壞條件下的分子尤為有用。此類分子需要快速分離并轉移至適合的非破壞環(huán)境中。使用膜層析法可降低目標分子在分離過程中被破壞的風險。
膜層析法擁有針對 IEX、耐鹽 IEX 或 HIC的結合位點。層析膜也是即拆即用、無需裝填，具有囊式和卡盒式多種規(guī)格可選，使用靈活，可輕松適應各種不同工藝。
膜孔徑大，因此層析膜特別適合分離囊泡、病毒等大顆粒。但采用結合-洗脫模式分離蛋白質等小分子時，使用膜層析法很難達到高結合載量。相反，層析膜常被用于在工藝后期通過流穿方式去除雜質。此時層析膜可以結合最后的少量雜質，并讓目標產物直接流過而不與結合位點相互作用。
在生物制造領域，膜層析法被廣泛應用于在流穿模式下去除痕量雜質和污染物，在去除內毒素、宿主細胞蛋白質、DNA 和病毒污染物等方面已相當成熟。在結合-洗脫模式下，使用膜基質純化病毒和核酸極其有效。
關于層析基質的最終選擇
選擇層析基質和分離模式不是非此即彼，即使有時會感覺選擇了其中一種便放棄了其他所有。真實的純化工藝通常比較復雜，需要進行多輪層析。在這種情況下，可能需要混合搭配不同層析基質和分離方法，才能確保在工藝流程的每個階段都獲得最佳結果。
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