利用斑馬魚模型評價肺炎防治作用

利用斑馬魚模型評價肺炎防治作用【評價原理】

斑馬魚的鰾從器官進化、組織結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)等多個層面都類似于哺乳動物的肺泡。我們與浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院從事慢阻肺研究的團隊合作，進行魚鰾損傷模型與肺損傷相關(guān)性研究。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)微顆粒、細(xì)菌、腫瘤細(xì)胞以及肺炎患者的灌洗液都會引起斑馬魚鰾損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致斑馬魚鰾破裂。通過我們所做的機制方面的研究及實驗證明，斑馬魚模型可以作為急性肺損傷研究的新模型，進而可以用于肺損傷治療或者預(yù)防的有關(guān)藥物的篩選。

（1）細(xì)菌性肺炎：注射給予LPS建立斑馬魚肺炎模型。LPS是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，來源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的外膜，是內(nèi)毒素的主要成分。接觸一定量的LPS會引起機體支氣管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血癥。

（2）病毒性肺炎：注射給予聚肌胞——poly（i:c）建立斑馬魚肺炎模型。poly（i:c）的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)非常類似于病毒或病毒復(fù)制過程中形成的雙鏈RNA，所以poly（i:c）類似某些病毒，具有很強的干擾素誘生作用。

通過使用轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光斑馬魚，在熒光顯微鏡下可以直接觀察斑馬魚中性粒細(xì)胞，使用實時熒光定量PCR儀可獲得基因表達(dá)水平，通過制作組織病理切片觀察斑馬魚魚鰾部位的病理結(jié)構(gòu)變化。

利用斑馬魚模型評價肺炎防治作用【實驗方案】

（1）我們將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和抗肺炎藥物組。其中，模型對照組與抗肺炎藥物都注射了等量的LPS建立肺炎模型?？狗窝姿幬镌谧⑸淞薒PS的同時攝入吲哚美辛之類的抗肺炎藥物。

（2）我們將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和抗肺炎藥物組。其中，模型對照組與抗肺炎藥物都注射了等量的聚肌胞——poly（i:c）建立肺炎模型。抗肺炎藥物在注射了poly（i:c）的同時攝入吲哚美辛之類的抗肺炎藥物。

服用一段時間抗肺炎藥物后，我們在熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚中性粒細(xì)胞，用實時熒光定量PCR儀檢測TNF-α、IL-1β值，同時制作成病理切片觀察魚鰾部位的病理結(jié)構(gòu)變化。

【結(jié)果展示】

圖1. 斑馬魚中性粒表型圖

黃色虛線區(qū)域為魚鰾，綠色熒光顆粒為中性粒細(xì)胞

可以看到，服用抗肺炎藥物組斑馬魚魚鰾位置處的中性粒細(xì)胞與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組中性粒細(xì)胞明顯增多的情況。

圖2. TNF-α、IL-1β基因表達(dá)水平

與模型對照組比較，***p < 0.001

可以看到，服用抗肺炎藥物組斑馬魚的炎癥基因表達(dá)水平與正常對照組較為接近，未出現(xiàn)模型對照組炎癥基因的表達(dá)水平明顯升高的情況。

圖3. 魚鰾部位病理切片

從病理切片中也能看出來，服用抗肺炎藥物組斑馬魚魚鰾病理結(jié)構(gòu)與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組滲入的中性粒細(xì)胞數(shù)的情況。

【評價結(jié)論】

1.經(jīng)過每組30尾斑馬魚的對比實驗，服用抗肺炎藥物在中性粒細(xì)胞、炎癥基因表達(dá)和病理結(jié)構(gòu)均與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加炎癥基因表達(dá)水平明顯升高和病理出現(xiàn)中性粒細(xì)胞滲出的情況。

2.本實驗證實了吲哚美辛具有顯著的防治肺炎作用。