目的：應(yīng)用人類肺癌、胃癌和肝癌細(xì)胞斑馬魚異種移植模型，分別評(píng)價(jià)５種臨床常用抗癌藥的體內(nèi)敏感性。方法 ：分別建立斑馬魚肺癌 Ａ549、胃癌SGC-7901和肝癌ＨepＧ２ 異種移植模型，順鉑、紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、恩度和貝伐單抗設(shè)計(jì)３個(gè)劑量分別處理斑馬魚肺癌Ａ549 移植模型，紫杉醇、伊立替康、羥基脲、順鉑和５?氟尿嘧啶（５?fluorouracil，５-FU）設(shè)計(jì)2個(gè)濃度或劑量分別處理斑馬魚胃癌SGC-7901移植模型，阿霉素、吉西他濱、羥基脲、順鉑和 ５?氟尿嘧啶設(shè)計(jì)3個(gè)濃度或劑量分別處理斑馬魚肝癌ＨepＧ2移植模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用熒光顯微鏡進(jìn)行體內(nèi)腫瘤定量圖像分析，計(jì)算藥物對(duì)斑馬魚體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制率，通過(guò)與模型對(duì)照組相比，分析是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果：受試的抗腫瘤藥物在斑馬魚腫瘤異種移植模型中均有效，并且基本都呈劑量依賴性。在抗肺癌 Ａ549藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到低分別為貝伐單抗（65％）＞順鉑（55％）＞長(zhǎng)春瑞濱（40％）＞恩度（39％ ）＞紫杉醇（27％）；在抗胃癌SGC-7901藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到底分別為羥基脲（46％ ）＞ ５-FU（31％ ）＝伊立替康（31％ ）＞紫杉醇（26％ ） ＞ 順鉑（24％ ）；在抗肝癌ＨepＧ2藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到底分別為順鉑（64％ ） ＞ 羥基脲（56％ ）＞吉西他濱（46％ ）＞ 阿霉素（４５％ ）＞ ５-FU（38％ ）。結(jié)論：斑馬魚腫瘤異種移植模型適合用于抗癌藥體內(nèi)藥敏試驗(yàn)。

● 綜述

世界上每年都會(huì)出現(xiàn)大量新的抗腫瘤候選物，大量的人力物力不斷地投入到抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)中，然而，每年都有大量的抗腫瘤藥物在前期的開(kāi)發(fā)中給科學(xué)家?guī)?lái)希望，但在后期的臨床研究中被證明是無(wú)效的，由此造成的時(shí)間、金錢、精力成本巨大。 因此，尋找一種在藥物開(kāi)發(fā)早期便能夠迅速、準(zhǔn)確、高效評(píng)價(jià)抗腫瘤候選物藥效的方法非常必要。

斑馬魚作為一種重要的模式生物，早期主要應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)研究和有毒物質(zhì)的檢測(cè) 。近些年來(lái)，斑馬魚在各類藥物的藥效評(píng)價(jià)方面也起到了越來(lái)越重要的作用 。斑馬魚作為一種整體的活體動(dòng)物模型，在藥物評(píng)價(jià)方面，具備藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄的完整過(guò)程，并且由于其本身的物理特性，斑馬魚又具有類似體外細(xì)胞、分子生物學(xué)手段快速、高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，是細(xì)胞等體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦^(guò)渡到鼠科等哺乳動(dòng)物模型中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)動(dòng)物模型，在藥物的臨床前研究階段有較高應(yīng)用價(jià)值。

斑馬魚腫瘤異種移植模型是抗腫瘤藥物研發(fā)中一種新興的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的早期篩選實(shí)驗(yàn) ，但并未見(jiàn)關(guān)于使用該模型專門評(píng)價(jià)已上市藥物藥敏性的報(bào)道。 因此，本研究以斑馬魚腫瘤移植為動(dòng)物模型，驗(yàn)證臨床常用的抗腫瘤藥物在該模型上的藥敏性，旨在探索斑馬魚腫瘤異種移植模型是否能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的效果，為該模型應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

● 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 斑馬魚腫瘤異種移植模型的建立

將標(biāo)記好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為 ３×107個(gè)細(xì)胞／ｍＬ，使用顯微注射儀將細(xì)胞注射至2dpf 斑馬魚卵黃囊內(nèi)，注射體積10ｎL，每尾斑馬魚約注射300個(gè)細(xì)胞。 注射細(xì)胞后的斑馬魚放置35℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24ｈ后在熒光顯微鏡下篩選熒光量一致的斑馬魚，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組，每組30尾斑馬魚。

1.2 藥物處理

根據(jù)臨床用藥相對(duì)應(yīng)的方式，臨床口服藥物對(duì)應(yīng)斑馬魚水溶給藥，臨床靜脈注射藥物對(duì)應(yīng)斑馬魚靜脈注射給藥。 通過(guò)濃度摸索實(shí)驗(yàn)，得到各抗癌藥物在斑馬魚上的耐受劑量（ ＭＴＤ）或濃度（ＭＴＣ）。 在體內(nèi)藥敏試驗(yàn)中，各藥物均選擇 ３ 個(gè)劑量或濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為 ＭＴＤ／４、ＭＴＤ／２和ＭＴＤ，ＭＴＣ／４、ＭＴＣ／２ 和 ＭＴＣ?？狗切〖?xì)胞肺癌Ａ549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表 １。抗胃癌 ＳＧＣ?７９０１ 細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表 ２?？垢伟萫pＧ2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)組別和劑量設(shè)置見(jiàn)表 ３。移植腫瘤的斑馬魚，不加任何藥物處理的為模型對(duì)照組。

1.3 熒光拍照及數(shù)據(jù)采集

抗癌藥物處理至5dpf時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并保 存 圖 片。進(jìn)行圖像分析，計(jì)算癌細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度總和（Ｓ） ，定量評(píng)價(jià)各抗癌藥物對(duì)斑馬魚體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。腫瘤抑制作用計(jì)算公式如下：

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析，與模型對(duì)照組相比較，Ｐ＜0.05為差異有顯著性。

● 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的藥敏

抗非小細(xì)胞肺癌Ａ549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表４ 和圖１所示。 其中，抗肺癌Ａ549細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚100、200和400ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為 ４％ 、57％ 和 65％ ，與模型對(duì)照組比較分別為 Ｐ ＞0.5，Ｐ ＜ 0.001和 Ｐ ＜0.001，當(dāng)貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚200和 400ng時(shí)對(duì)肺癌Ａ549細(xì)胞有顯著的抑制作用。 順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、１ 和 ２ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為34％ 、35％ 和 55％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌Ａ549細(xì)胞有顯著的抑制作用。 恩度在劑量為每尾斑馬魚20、40和80ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為11％ 、12％ 和39％ ，與模型對(duì)照組比較，當(dāng)在劑量為每尾斑馬魚80ng時(shí)對(duì)肺癌Ａ549細(xì)胞有顯著的抑制作用。 紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚0.86、1.71和2.56ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為24％ 、25％ 和27％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌Ａ549細(xì)胞有顯著的抑制作用。 長(zhǎng)春瑞濱在劑量為每尾斑馬魚0.125、0.25和 0.5ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為 28％ 、40％ 和40％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肺癌Ａ549細(xì)胞有顯著的抑制作用。

可見(jiàn)， 抗肺癌Ａ549藥效從高到低的藥物分別為貝伐單抗（65％ ）＞ 順鉑（55％ ） ＞ 長(zhǎng)春瑞濱（40％ ） ＞ 恩度（39％ ） ＞紫杉醇（27％ ）。

2. 抗胃癌SGC-7901細(xì)胞的藥敏

抗胃癌SGC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表5和圖２所示。 其中，抗胃癌SGC-7901細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，5-FU在濃度為65、130和260μｇ／ｍＬ時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為31％ 、29％ 和29％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。

羥基脲在濃度為250、500和1000μｇ／ｍＬ時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為 29％ 、31％ 和46％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、1和2ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為 ５％ 、５％ 和24％ ，與模型對(duì)照組比較，當(dāng)順鉑在劑量為每尾斑馬魚2ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。 伊立替康在劑量為每尾斑馬魚 0.5、１和2ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為4％ 、31％ 和30％ ，與模型對(duì)照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ ＜0.001和 Ｐ ＜0.001，當(dāng)伊立替康在劑量為每尾斑馬魚1和2ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。 紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚0.86、1.71和2.56ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為３％、25％和26％ ，與模型對(duì)照組比較分別為 Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.05和 Ｐ＜0.05，當(dāng)紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚1.71和2.56ng時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞有顯著的抑制作用。

可見(jiàn)，抗胃癌SGC-7901藥效從高到低的藥物分別為羥基脲（46％）＞ 5-FU（31％）＝ 伊立替康（31％）＞ 紫杉醇（26％）＞ 順鉑（24％）。

3 抗肝癌HepG2細(xì)胞的藥敏

抗肝癌HepG2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表６和圖３所示。其中，抗肝癌ＨepＧ2細(xì)胞藥敏試驗(yàn)中，阿霉素在劑量為每尾斑馬魚0.5、1和2ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為17％、42％和45％ ，與模型對(duì)照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.001和Ｐ＜0.001，當(dāng)阿霉素在劑量為每尾斑馬魚1和2ng時(shí)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。吉西他濱在劑量為每尾斑馬魚５、10和20ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為46％、45％和46％，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。

羥基脲在濃度為125、250和500μｇ／ｍＬ時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為33％ 、56％和40％ ，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、１和２ng時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為45％、50％和64％，與模型對(duì)照組比較，均對(duì)肝癌ＨepＧ2細(xì)胞有顯著的抑制作用。 ５?ＦＵ 在濃度為65、130和260μｇ／ｍＬ 時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為15％ 、33％ 和38％ ，與模型對(duì)照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.01和Ｐ＜0.01，當(dāng) ５?ＦＵ 在濃度為130和260μｇ／ｍＬ時(shí)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的抑制作用。

可見(jiàn)，抗肝癌HepG2藥效從高到低的藥物分別為順鉑（64％）＞ 羥 基 脲（56％ ）＞ 吉 西 他 濱（46％ ） ＞ 阿霉素（45％ ）＞ ５?ＦＵ（38％ ）。

● 討論

本研究選取三類人群中常見(jiàn)的腫瘤類型作為測(cè)試疾病對(duì)象，以臨床上每類腫瘤對(duì)應(yīng)的常規(guī)化療藥物作為測(cè)試的藥物對(duì)象，以斑馬魚腫瘤異種移植模型作為檢測(cè)的生物模型，目的在于評(píng)價(jià)斑馬魚腫瘤異種移植模型是否能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)抗癌藥物的藥敏性。

本研究結(jié)果證實(shí)，在臨床上抗非小細(xì)胞肺癌藥物、抗胃癌藥物、抗肝癌藥物，在斑馬魚腫瘤異種模型上同樣能體現(xiàn)出其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，且明顯具有劑量依賴效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在斑馬魚腫瘤異種移植模型中，就抗腫瘤藥物對(duì)特定腫瘤的治療效果來(lái)看，各類抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果是有優(yōu)劣之分的。

對(duì)于理化性質(zhì)和作用機(jī)制各異的抗癌藥物，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床上的服用方式，相應(yīng)地給予斑馬魚口服（水溶）給藥或者靜脈注射給藥。結(jié)果證實(shí)，這些藥物在斑馬魚體內(nèi)不僅都體現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效果，而且結(jié)果與臨床用藥基本一致。 這提示我們，斑馬魚腫瘤異種移植模型是一類可靠的、靈敏的、能夠在體內(nèi)測(cè)定藥物抗癌效用的動(dòng)物模型。

基于斑馬魚自身的物理特性優(yōu)勢(shì)及對(duì)抗腫瘤藥物的藥敏性，斑馬魚腫瘤異種移植模型是一類非常有應(yīng)用前景的抗腫瘤動(dòng)物模型，我們預(yù)測(cè)未來(lái)該模型將會(huì)在抗腫瘤藥物的新藥研發(fā)、老藥再評(píng)價(jià)、藥物聯(lián)用組方篩選、耐藥測(cè)試乃至人源的腫瘤移植?精準(zhǔn)醫(yī)療中獲得更加廣泛的應(yīng)用。