2022《保健食品功能評價斑馬魚試驗規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)解讀

標(biāo)準(zhǔn)背景

2022年4月15日，由中國保健協(xié)會管理歸口，杭州環(huán)特生物科技股份有限公司牽頭，中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所、中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所、中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所等22家企業(yè)、科研院所共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)——《保健食品功能評價 斑馬魚試驗規(guī)程》（T/CHC2003-2022）正式發(fā)布并實施。

為了使大家更好地了解《保健食品功能評價斑馬魚試驗規(guī)程》這一團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)重點內(nèi)容，幫助更多的保健食品企業(yè)在研發(fā)中更好地應(yīng)用斑馬魚技術(shù)開展斑馬魚實驗，從而適應(yīng)保健食品行業(yè)消費(fèi)者需求變化快、產(chǎn)品研發(fā)周期短的發(fā)展趨勢，環(huán)特生物推出“團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)解讀”系列，供大家參考。第一期《標(biāo)準(zhǔn)解讀（一） | 《保健食品功能評價斑馬魚試驗規(guī)程》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)解讀！》（點擊可回顧）已推出。

今天，我們將為大家送上第二期，快一起來看吧↓↓

主要內(nèi)容及解讀

正式試驗內(nèi)容及解讀

1. 試驗分組

標(biāo)準(zhǔn)原文：

正式試驗按照以下方法挑選斑馬魚置于微孔板中進(jìn)行分組：

a) 正常對照組：含斑馬魚及標(biāo)準(zhǔn)稀釋水；

b) 模型對照組：含有模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚；

c) 陽性對照組：含有陽性對照樣品、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚。每次試驗設(shè)置一個陽性對照組即可；

d) 受試樣品測試組：含有受試樣品、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚。將受試樣品儲備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以幾何級數(shù)稀釋成一組適宜的濃度系列，備用。宜設(shè)置3～5個濃度組，以幾何級數(shù)濃度系列設(shè)置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數(shù)≤3.2，宜設(shè)為2；

e) 溶劑對照組：含有助溶劑、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚。當(dāng)受試樣品配制過程中使用了助溶劑，應(yīng)設(shè)置該組，助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V）。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

正式試驗設(shè)置正常對照組、模型對照組、陽性對照組、受試樣品測試組（宜設(shè)置3～5個濃度組，以幾何級數(shù)濃度系列設(shè)置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數(shù)≤3.2，宜設(shè)為2）、溶劑對照組（當(dāng)受試樣品配制過程中使用了助溶劑，應(yīng)設(shè)置該組，助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V））。

對于助溶劑的使用*，根據(jù)長期積累的數(shù)據(jù)以及本標(biāo)準(zhǔn)涉及到實驗內(nèi)容的特點，本標(biāo)準(zhǔn)將助溶劑的濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%。在實驗溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應(yīng)超過0.1%。只有當(dāng)受試樣品溶解性確實不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度增加到1%。

2. 造模

標(biāo)準(zhǔn)原文：

選擇受精后一定天數(shù)的斑馬魚，用誘導(dǎo)劑處理一段時間，建立斑馬魚保健食品功能評價模型。根據(jù)保健食品功能選擇合適的斑馬魚模型。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

不同保健食品功能選擇的斑馬魚模型不同，造模方式也不一樣。選擇受精后一定天數(shù)的一定品系的斑馬魚，用誘導(dǎo)劑處理一定的時間，建立斑馬魚保健食品功能評價模型。根據(jù)保健食品功能選擇合適的斑馬魚模型，不同斑馬魚模型的建立方法。

3. 受試樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)原文：

根據(jù)試驗需求，預(yù)先篩選好足夠數(shù)量且發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，并隨機(jī)分配到試驗容器中，每孔斑馬魚數(shù)量至少為10尾。用模型誘導(dǎo)劑建立斑馬魚模型，然后向試驗容器中加入一定體積的受試樣品溶液（飼養(yǎng)密度宜為1尾/100μL）、陽性對照樣品。充分混勻后，用鋁箔紙包裹，在28℃生化培養(yǎng)箱中避光孵育至終點。

4. 死亡與毒性判斷

標(biāo)準(zhǔn)原文：

當(dāng)所有試驗組斑馬魚死亡率≤10%時，準(zhǔn)許進(jìn)入數(shù)據(jù)采集階段。

5. 數(shù)據(jù)采集

標(biāo)準(zhǔn)原文：

應(yīng)根據(jù)不同斑馬魚保健食品功能評價模型的具體評價指標(biāo)選擇合適的數(shù)據(jù)采集方式，數(shù)據(jù)采集具體方式如下：

a) 直接拍照：孵育結(jié)束后，從表型正常的斑馬魚中隨機(jī)選取至少10尾斑馬魚，用三卡因麻醉后，將斑馬魚用3%甲基纖維素固定（甲基纖維素應(yīng)提前在室溫放置至少30分鐘），在體視顯微鏡或熒光顯微鏡（轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚品系相關(guān)的試驗）下觀察、拍照并保存。所有試驗組斑馬魚拍照應(yīng)在相同的儀器和環(huán)境條件下完成，且斑馬魚體位保持一致。利用圖像處理軟件測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

b) 染色后拍照：孵育結(jié)束后，試驗容器中的斑馬魚用養(yǎng)殖水清洗3次，采用特異性熒光染料或組織化學(xué)染料對各組斑馬魚進(jìn)行染色。染色后各組至少取10 尾斑馬魚，用3%甲基纖維素固定。特異性熒光染料染色的斑馬魚用熒光顯微鏡觀察、拍照并保存，組織化學(xué)染料染色的斑馬魚用體視顯微鏡觀察、拍照并保存。利用圖像處理軟件對圖像進(jìn)行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

c) 運(yùn)動行為分析：孵育結(jié)束后，試驗容器中的斑馬魚用養(yǎng)殖水清洗3次，每個試驗組隨機(jī)選擇斑馬魚轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔1尾，利用行為分析儀記錄斑馬魚的運(yùn)動軌跡，記錄時間宜為20 min～1 h，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

d)酶標(biāo)儀檢測：孵育結(jié)束后，試驗容器中的斑馬魚用養(yǎng)殖水清洗3次，每個試驗組隨機(jī)選擇斑馬魚轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔1～3尾，按照試劑盒檢測說明書進(jìn)行試驗操作，利用酶標(biāo)儀測定OD值、熒光值或生物光值。選擇符合檢測試劑要求的激發(fā)波長和發(fā)射波長，檢測時間宜為20 min～1 h，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于3個。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

應(yīng)根據(jù)不同斑馬魚功能評價模型的具體評價指標(biāo)選擇合適的數(shù)據(jù)采集方式，數(shù)據(jù)采集具體方式如下：

a）直接拍照：斑馬魚的膽囊在斑馬魚軀干偏右側(cè)，當(dāng)斑馬魚側(cè)躺時，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會對拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點瓊脂糖或甲基纖維素等對斑馬魚進(jìn)行固定。斑馬魚從開始麻醉到拍照結(jié)束的時間不宜超過30分鐘，超過30分鐘可能會對斑馬魚造成損傷或?qū)е滤劳?。利用圖像處理軟件對圖像進(jìn)行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），為了保證后續(xù)統(tǒng)計分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

b）染色后拍照：拍照時一般要求斑馬魚應(yīng)頭朝左、腹部朝下、*側(cè)躺，所有斑馬魚的體位保持一致。斑馬魚的膽囊在斑馬魚軀干偏右側(cè)，當(dāng)斑馬魚側(cè)躺時，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會對拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點瓊脂糖或甲基纖維素等對斑馬魚進(jìn)行固定。熒光顯微鏡拍照時，相機(jī)的相關(guān)參數(shù)設(shè)置應(yīng)既能保證拍到熒光信號、又能很大程度減少背景噪點，盡量減少背景干擾。整個熒光顯微鏡拍照過程中要盡量減少可見光照射或照射強(qiáng)度，以免熒光試劑猝滅過快，干擾實驗結(jié)果。斑馬魚從開始麻醉到拍照結(jié)束的時間不宜超過30分鐘，超過30分鐘可能會對斑馬魚造成損傷或?qū)е滤劳觥＠脠D像處理軟件對圖像進(jìn)行分析，測量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），為了保證后續(xù)統(tǒng)計分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

c）運(yùn)動行為分析：正式記錄前，根據(jù)實驗需求可進(jìn)行預(yù)跑10 min，以檢測及維持儀器穩(wěn)定并可使斑馬魚更好的適應(yīng)環(huán)境，記錄時間宜為20 min-1 h，為了保證后續(xù)統(tǒng)計分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

結(jié)果評價及解讀

1. 統(tǒng)計分析

標(biāo)準(zhǔn)原文：

1.1　利用統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行相關(guān)圖表制作與統(tǒng)計學(xué)分析。計算各組試驗的平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（Standard Error，SE），統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果用Mean ± SE表示。宜采用方差分析，按方差分析的程序進(jìn)行正態(tài)性檢驗（P值）和方差齊性檢驗（F值）。

1.2　當(dāng)F<0.05，P<0.05時，各組均數(shù)間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數(shù)檢驗。

1.3　當(dāng)F≥0.05，P≥0.05時，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4　對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

2. 結(jié)果有效性分析

標(biāo)準(zhǔn)原文：

2.1　正常對照組（當(dāng)使用了助溶劑，也包括溶劑對照組）斑馬魚的死亡率或異常率不得超過10%，超過10%則該次試驗結(jié)果視為無效。

2.2　模型對照組與正常對照組之間的原始數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，陽性對照組與模型對照組之間的原始數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗結(jié)果視為無效。

2.3　當(dāng)使用了助溶劑，溶劑對照組與正常對照組之間的原始數(shù)據(jù)不能存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗結(jié)果視為無效。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

根據(jù)前期積累的大量實驗數(shù)據(jù)以及本次用已上市保健食品和在研保健食品開展的驗證實驗結(jié)果，當(dāng)且僅當(dāng)一個實驗滿足如下的質(zhì)量控制要求時，實驗結(jié)果的有效性才會被認(rèn)可。只準(zhǔn)許有效試驗結(jié)果進(jìn)入試驗報告撰寫/審核階段。

實驗報告撰寫及解讀

標(biāo)準(zhǔn)原文：

試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

a) 檢測依據(jù)；

b) 受試樣品和陽性對照的信息，包括與試驗操作相關(guān)的理化性狀；

c) 斑馬魚來源和品系等相關(guān)信息；

d) 試驗條件和方法，包括試驗具體步驟；

e) 試驗開始至完成的日期；

f) 試驗結(jié)果，包括測定數(shù)據(jù)、計算值、圖像數(shù)據(jù)等；

g) 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法；

h) 結(jié)論。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

試驗報告應(yīng)包括：檢測依據(jù)、受試樣品和陽性對照的信息、斑馬魚來源和品系等相關(guān)信息、試驗條件和方法、試驗開始至完成的日期、試驗結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法、結(jié)論。

實施意義

該標(biāo)準(zhǔn)是環(huán)特生物攜手國內(nèi)22家科研院所、企業(yè)發(fā)布的用于食品保健功能檢測的完整斑馬魚技術(shù)規(guī)程，不僅補(bǔ)上了我國食品保健功能檢測領(lǐng)域斑馬魚技術(shù)規(guī)程團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的空白，從檢測依據(jù)、斑馬魚來源和品系等信息、試驗條件和方法、試驗結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法、推薦參數(shù)等關(guān)鍵技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行了充分的實驗規(guī)范規(guī)定及技術(shù)創(chuàng)新，其結(jié)果適用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能評價。

而且，該標(biāo)準(zhǔn)將進(jìn)一步助力我國斑馬魚技術(shù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)體系的完善，全面提升我國斑馬魚技術(shù)在保健食品行業(yè)功能評價方面的標(biāo)準(zhǔn)化及應(yīng)用化水平等，對行業(yè)具有重要的指導(dǎo)性意義與推動性作用。