斑馬魚(yú)作為發(fā)育毒性試驗(yàn)的一種替代動(dòng)物模型，近年來(lái)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但其檢測(cè)方案尚未統(tǒng)一。

9月初， SCI期刊《Frontiers in Cell and Developmental Biology》（JCR分區(qū)：發(fā)育生物學(xué)類1區(qū)，IF=6.684）上發(fā)表了題為《Validation, Optimization, and Application of the Zebrafish Developmental Toxicity Assay for Pharmaceuticals Under the ICHS5(R3) Guideline》的高分研究論文。

該研究成果由環(huán)特生物、浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(杭州醫(yī)學(xué)院)安全性評(píng)價(jià)研究中心、浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(杭州醫(yī)學(xué)院)浙江省藥品安全評(píng)價(jià)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、浙江工業(yè)大學(xué)長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心共同發(fā)表，也是環(huán)特生物發(fā)表的第99篇研究論文。

該研究在ICH指導(dǎo)原則下，驗(yàn)證并優(yōu)化了先前由美國(guó)和歐洲的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間研究報(bào)告的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性測(cè)定，并證實(shí)了：斑馬魚(yú)作為一種發(fā)育毒性與致畸性試驗(yàn)的替代動(dòng)物模型，可達(dá)到90.3%靈敏度（28/31個(gè)陽(yáng)性化合物對(duì)具有致畸作用）和 88.9% (40/45) 總體可預(yù)測(cè)性。這項(xiàng)研究結(jié)果充分支持使用斑馬魚(yú)作為替代體內(nèi)方法來(lái)篩選和評(píng)估候選藥物的發(fā)育毒性與致畸性以供監(jiān)管、使用，可用于新藥IND人體臨床實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)。

一起來(lái)看論文主要內(nèi)容——

發(fā)育毒性與致畸性試驗(yàn)研究概述

發(fā)育毒性和致畸性是一個(gè)嚴(yán)重的安全問(wèn)題，大約 5-10% 的人類新生兒先天性異常是由致畸劑引起的。1966 年，沙利度胺的發(fā)育影響得到認(rèn)可后，食品和藥物管理局 (FDA) 制定了用于評(píng)估藥物在批準(zhǔn)供人類使用之前對(duì)生殖和發(fā)育的影響的方案。

此外，目前有超過(guò) 143,835 種預(yù)先注冊(cè)的化學(xué)品可能污染食品和環(huán)境，但這些和其他現(xiàn)有化學(xué)品中約有 86% 沒(méi)有安全測(cè)試數(shù)據(jù)。

出于對(duì)化學(xué)品安全性的擔(dān)憂，歐洲化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、授權(quán)和限制 (REACH) 計(jì)劃制定了協(xié)議（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織 (OECD) 指南 TG 414、TG 416 、TG 421和 TG 422），以收集每年生產(chǎn)或銷售數(shù)量超過(guò) 1 噸的所有化學(xué)品的此類數(shù)據(jù)。這種情況促使研究發(fā)育毒性測(cè)試的替代方法，即全胚胎培養(yǎng) (WEC) 測(cè)試 、哺乳動(dòng)物微量 (MM) 測(cè)試 和胚胎干細(xì)胞測(cè)試。前兩種模型仍然使用完整的哺乳動(dòng)物作為測(cè)試系統(tǒng)，一個(gè)一直是有爭(zhēng)議的領(lǐng)域。事實(shí)上，這些測(cè)試并沒(méi)有涵蓋胚胎發(fā)育的整個(gè)時(shí)期。

斑馬魚(yú)作為一種非哺乳類脊椎動(dòng)物，具有多種替代毒性測(cè)定的優(yōu)勢(shì)，如經(jīng)濟(jì)飼養(yǎng)要求、胚胎透明度、高繁殖力和 6-384 孔板高通量篩選等。此外，斑馬魚(yú)也是發(fā)育毒性測(cè)試的適用模型，過(guò)去 10 年中實(shí)際上已經(jīng)在斑馬魚(yú)中評(píng)估了藥物和化合物的發(fā)育毒性，如表 1（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織 [經(jīng)合組織]，2011 年；經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織 [經(jīng)合組織]，2012 年）。

表 1. 已發(fā)表的通過(guò)斑馬魚(yú)來(lái)評(píng)估化合物的發(fā)育毒性

在四個(gè)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)盲法研究中，通過(guò)斑馬魚(yú)測(cè)試了 20 種非化合物的發(fā)育毒性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都實(shí)現(xiàn)了與哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)相似的整體一致性（60-70%）。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)并考慮斑馬魚(yú)胚胎攝取后，在該項(xiàng)目的第二階段，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室評(píng)估了 38 種專有藥物化合物，實(shí)現(xiàn)了 62-82% 的總一致性。在其他研究中，斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)在佛蘭德技術(shù)研究所和 Phylonix 制藥公司分別實(shí)現(xiàn)了 50-60% 和 92% 的總體預(yù)測(cè)值。

明顯可以看出，這些來(lái)自斑馬魚(yú)試驗(yàn)的發(fā)育毒性報(bào)告并不統(tǒng)一：致畸性的定義、結(jié)果的可預(yù)測(cè)性、與實(shí)驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)分析相關(guān)的多個(gè)細(xì)節(jié)以及濃度設(shè)置的合理性都沒(méi)有得到充分優(yōu)化和驗(yàn)證。

國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議 (ICH) 協(xié)調(diào)指南 S5(R3)（國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議 [ICH]，2017 年、2020 年）的發(fā)布和實(shí)施正在推動(dòng)著中國(guó)發(fā)育毒性試驗(yàn)替代方法的進(jìn)步。在中國(guó)參與修訂的國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）S5（R3）第2步指南草案（2017）（國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議[ICH]，2017）中引入替代測(cè)試系統(tǒng)是大的更新之一，也是頭一次在ICH安全性評(píng)價(jià)指南中大量增加替代試驗(yàn)方法的內(nèi)容。

ICH 指南建議使用替代體外和非哺乳動(dòng)物體內(nèi)生殖試驗(yàn)用于胚胎-胎兒發(fā)育毒性 (EFD) 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。ICH S5(R3) 終版本（2020 年）明確指出，從單獨(dú)進(jìn)行或與一項(xiàng)或多項(xiàng)體內(nèi)研究結(jié)合進(jìn)行的合格替代測(cè)定所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用于支持在有限情況下的危害識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。然而，斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)已在國(guó)內(nèi)外用于研究性新藥（IND）申請(qǐng)，但尚未得到中國(guó)藥品監(jiān)督管理部門的正式認(rèn)可。

在這項(xiàng)研究中，我們打算在國(guó)際上驗(yàn)證和優(yōu)化初步建立的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)作為替代體內(nèi)試驗(yàn)，并希望得到中國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)管認(rèn)可。遵循 ICH 參考化合物列表，根據(jù)其類別從 66 種化合物中選擇了 45 種化合物用于致畸性實(shí)驗(yàn)：50 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照中的 31 個(gè)和 16 個(gè)陰性對(duì)照中的 14 個(gè)。

我們已經(jīng)評(píng)估并驗(yàn)證了起初由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間研究報(bào)告的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性測(cè)定方案，此處稱為“經(jīng)典方案"。結(jié)合我們的經(jīng)驗(yàn) 和其他研究，我們優(yōu)化了原始經(jīng)典方案，并進(jìn)一步提高了其在 ICH 下藥物使用的可預(yù)測(cè)性S5(R3) 指南。

此外，還應(yīng)用了三種非 ICH 參考化合物綠原酸、雷公藤內(nèi)酯來(lái)測(cè)試斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)。本研究的結(jié)果表明，本報(bào)告中優(yōu)化和驗(yàn)證的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)是一種可靠且可重復(fù)的非哺乳動(dòng)物體內(nèi)方法，用于篩選和評(píng)估候選動(dòng)物的致畸性（即畸形或胚胎-胎兒致死率，MEFL）化合物。

優(yōu)化斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)

“優(yōu)化前"，斑馬魚(yú)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，31個(gè)ICH陽(yáng)性化合物中，23個(gè)化合物（74.2%）對(duì)斑馬魚(yú)有致畸作用，8個(gè)具有致畸性，假陰性結(jié)果；在 14 種 ICH 陰性化合物中，12 種化合物 (85.7%) 在斑馬魚(yú)中無(wú)致畸性，2 種具有假陽(yáng)性結(jié)果，總體一致性為 77.8% (35/45)。

斑馬魚(yú)中陰性對(duì)照（非致畸劑）化合物的發(fā)育毒性結(jié)果共包含 14 個(gè)陰性對(duì)照，12 種非致畸化合物對(duì)斑馬魚(yú)的影響與 ICH 分類高度一致，但鹽酸賽庚啶和鹽酸環(huán)苯扎林被 ICH 歸類為陰性對(duì)照，但呈現(xiàn)為假-斑馬魚(yú)測(cè)試的陽(yáng)性結(jié)果。

Cyproheptadine hydrochloride 產(chǎn)生顯著的致畸表型，包括心包水腫、心動(dòng)過(guò)緩、血流缺失、下巴過(guò)大、眼睛小、肝變性、卵黃囊吸收延遲、腎水腫和魚(yú)鰾丟失，濃度為 10 μM，斑馬魚(yú)死亡 25% 100 和 1000 μM 時(shí) 100% 死亡。鹽酸環(huán)苯扎林在 100 μM 時(shí)誘導(dǎo)明顯的肝變性和下頜過(guò)大，在 1000 μM 時(shí)有 8.3% 的死亡和 100% 的死亡。

表 2. 斑馬魚(yú)陽(yáng)性對(duì)照（致畸劑）化合物的發(fā)育毒性結(jié)果

在起初的經(jīng)典協(xié)議中，斑馬魚(yú)的發(fā)育毒性僅在 5 dpf 時(shí)進(jìn)行評(píng)估，從而導(dǎo)致更高的假陰性結(jié)果。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在 2 dpf 和 5 dpf 評(píng)估的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性可以為陽(yáng)性致畸化合物提供更好的可預(yù)測(cè)性。

為了驗(yàn)證優(yōu)化的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性測(cè)定，使用新的協(xié)議和標(biāo)準(zhǔn)在斑馬魚(yú)中測(cè)試了三種非 ICH 化合物。如表 3所示，在 2 dpf 時(shí)，在 0.1 μM 雷公藤內(nèi)酯處理的斑馬魚(yú)中未觀察到與化合物相關(guān)的毒性表型和死亡，但 12 條斑馬魚(yú)在 1 μM 時(shí)出現(xiàn)心包水腫，12 條斑馬魚(yú)在 10 時(shí)死亡微米。在 5 dpf 時(shí)，0.1 μM 雷公藤內(nèi)酯處理導(dǎo)致 12 條斑馬魚(yú)腎水腫、心包水腫和心血管毒性，1 μM 時(shí) 3 條斑馬魚(yú)死亡，9 條斑馬魚(yú)出現(xiàn)畸形。因此，LC 25為 1 μM，NOAEL <0.1 μM。

表 3.優(yōu)化斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)對(duì)雷公藤內(nèi)酯和綠原酸的應(yīng)用

在 2 dpf 斑馬魚(yú)中，在 2 條斑馬魚(yú)中誘導(dǎo)了心包水腫、心血管毒性，并且在 100 μM 下沒(méi)有死亡，但在 10 μM 下沒(méi)有與化合物相關(guān)的發(fā)育不良；在 7 條斑馬魚(yú)中，心包水腫、心血管毒性和 1000 μM 無(wú)死亡。LC 25 > 1000 μM，NOAEL 為10 μM。在 5 dpf，10 μM 處理導(dǎo)致 12 條斑馬魚(yú)出現(xiàn)腎水腫和卵黃囊吸收延遲；在 100 μM 時(shí)，2 條斑馬魚(yú)死亡，10 條斑馬魚(yú)出現(xiàn)腎水腫和心包水腫，LC 25 > 100 μM，NOAEL 為 1 μM。

在 2 dpf 斑馬魚(yú)中，綠原酸處理未發(fā)現(xiàn)與化合物相關(guān)的毒性，10 μM 時(shí)觀察到死亡；在 100 μM 時(shí)，兩條斑馬魚(yú)死亡，但未觀察到其他發(fā)育不良，LC 25 > 100 μM，NOAEL 為 10 μM。在 5 dpf 時(shí)，在 10 μM 時(shí)未檢測(cè)到毒性；100 μM，2條斑馬魚(yú)死亡，6條斑馬魚(yú)魚(yú)鰾丟失，5條斑馬魚(yú)卵黃囊吸收延遲，LC 25 >100 μM，NOAEL為10 μM。雷公藤內(nèi)酯、綠原酸的 TI 值分別 >10、>100 和 >10，這三種化合物均被歸類為斑馬魚(yú)的致畸劑。這些結(jié)果通過(guò)圖 1所示的精細(xì)濃度測(cè)試得到了進(jìn)一步證實(shí)。

圖 1.應(yīng)用：雷公藤內(nèi)酯、綠原酸，對(duì) 5 dpf 的斑馬魚(yú)進(jìn)行處理。(A)未經(jīng)處理。(B) 0.5% DMSO。(C) 0.1 μM 雷公藤內(nèi)酯治療導(dǎo)致斑馬魚(yú)腎水腫、心包水腫和心血管毒性。(D) 100 μM 的處理導(dǎo)致斑馬魚(yú)出現(xiàn)腎水腫和心包水腫。(E) 100 μM 的綠原酸處理導(dǎo)致斑馬魚(yú)出現(xiàn)鰾丟失和卵黃囊吸收延遲。

總結(jié)

斑馬魚(yú)具有與哺乳動(dòng)物相似的生理、形態(tài)和功能，被認(rèn)為是評(píng)估候選藥物和化學(xué)品毒性和安全性的有價(jià)值的體內(nèi)模型。近年來(lái)，美國(guó)和歐洲多個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)和斑馬魚(yú)胚胎毒性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法、參數(shù)和預(yù)測(cè)靈敏度不一致（表1））。

大多數(shù)斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)需要將斑馬魚(yú)胚胎暴露于高達(dá) 5 dpf 以進(jìn)行生存能力和形態(tài)學(xué)評(píng)估。根據(jù)歐盟關(guān)于保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指令，獨(dú)立飼養(yǎng)是斑馬魚(yú)胚胎接受動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)定的階段。通常，孵化后的胚胎 > 5 dpf 被認(rèn)為是受保護(hù)的，因?yàn)轸~(yú)鰾已膨脹，可以自由游泳和自我進(jìn)食。因此，整個(gè)生物體檢測(cè)的設(shè)計(jì)符合與使用非受保護(hù)物種相關(guān)的定義。

參考國(guó)際上報(bào)道的斑馬魚(yú)發(fā)育毒性和致畸性評(píng)價(jià)方法，我們擬驗(yàn)證和優(yōu)化一種快速可靠的替代方法，有望在中國(guó)和世界范圍內(nèi)用于IND監(jiān)管。該方法通量高，節(jié)省新藥研發(fā)時(shí)間和成本。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，斑馬魚(yú)發(fā)育毒性測(cè)定靈敏度從 74.2% (23/31) 提高到 90.3% (28/31)，整體一致性從 77.8% (35/45) 提高到 88.9% (40/45) 。根據(jù) ECVAM（歐洲替代方法驗(yàn)證中心）評(píng)估新檢測(cè)預(yù)測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)，該檢測(cè)被評(píng)為優(yōu)秀 (>85%)用于鑒定發(fā)育毒性和致畸化合物。

正如 ICH S5(R3) 所指出的，使用合格的替代試驗(yàn)，例如非哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，可以減少動(dòng)物的使用，同時(shí)保持檢測(cè)相關(guān)生殖風(fēng)險(xiǎn)的能力，并且在某些情況下可以成為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的合適方法。此外，作為綜合測(cè)試策略的一部分，使用合格的替代檢測(cè)可能是推遲體內(nèi)測(cè)試的潛在方法。

這項(xiàng)研究結(jié)果，充分支持斑馬魚(yú)發(fā)育毒性試驗(yàn)作為體內(nèi)可預(yù)測(cè)的非哺乳動(dòng)物篩選和評(píng)估候選化合物的致畸性的方法，而這種斑馬魚(yú)試驗(yàn)可能是監(jiān)管認(rèn)可的有前途的替代測(cè)試系統(tǒng)。

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