一、實驗目的

本法為以Copure®  HLB(60mg/3mL)柱開發(fā)的針對動物源食品(豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品)中硝基呋喃類代謝物殘留檢測的樣本前處理凈化方法，HPLC法作為檢測手段。Copure™ HLB(60mg/3mL)柱凈化效果良好，回收率滿足測試要求，重現(xiàn)性好，與廠商同型號柱性能相當。

二、實驗目標物

四種硝基呋喃類代謝物：呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2- 噁唑烷基酮(縮寫AMOZ, CAS:43056-63-9)、代謝物氨基脲(縮寫SEM, CAS:563-41-7)、代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲(縮寫AHD,CAS:2827-56-7)和代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮(縮寫AOZ, CAS:80-65-9)。

三、應用范圍

本方法適用于動物源性食品包括豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品(魚類、蝦蟹類和貝類)中硝基呋喃類代謝物殘留檢測。

四、參考標準

《GB/T 20752-2006 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和《1077號公告-2-2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定》。

五、實驗材料

biocomma®Copure® HLB固相萃取柱60mg/3mL(Cat.No.COHLB360)；W品牌HLB固相萃取柱60mg/3mL。

六、實驗方法

1、樣品待測溶液制備

(1)樣品稱取脫脂
稱取待測樣品2 g(精確到0.01 g)，置于50 mL離心管中加入10 mL甲醇-水混合物(2:1)，振蕩混勻10 min，4000 r/min離心10 min，吸取清液棄掉、離心管中試樣備用。
(2)水解衍生化
向上述離心管中加入20 mL0.2 mol/L鹽酸，振蕩混勻10 min，后加入0.4 mL 0.05 mol/L 2-硝基(0.075 g2-硝基溶于10 mL 二甲亞砜)，渦旋混勻1 min，置于37 ℃恒溫振蕩器水浴中避光反應16h。
將上述衍生液，放置至室溫，加入5 mL0.1 mol/L溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到約7.4，4000 r/min離心10 min，上清液(對脂肪含量多的試樣，可加入5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 r/min離心5 min吸取并棄掉正己烷)待凈化。

2、SPE柱凈化

(1)活化：依次用5 mL甲醇、10 mL水活化。
(2)上樣和洗脫：取上述備用液控制流速小于2 mL/min過柱。待樣液全部通過后用10 mL水淋洗上樣柱，棄去全部流出液并真空抽干，最后用5 mL乙酸乙酯洗脫柱子上的待測成分。
(3)重新溶解：收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干，準確加入1 mL 乙腈/水(1:2, v/v)溶液溶解殘余物混勻，0.22 µm濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

3、HPLC條件

設備：Waters Alliance 2695
色譜柱：Welch Ultimate XB-C18 (250×4.6mm，5 µm)
檢測器：Waters 2487 雙波長檢測器；檢測波長：275nm
流動相：A:乙腈   B:0.01mol/L乙酸銨（0.77g乙酸銨，1000 mL水溶解，甲酸調(diào)pH 3.5 ）
洗脫方式：梯度洗脫
表1 洗脫梯度條件

柱溫：30 ℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20 µL

七、實驗結果

1、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結果
表2 添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結果

表3 W品牌同型號柱，添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結果

2、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測色譜圖

圖1  添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測色譜圖