超氧化物岐化酶(SOD)的應(yīng)用方案(三氮藍(lán)四唑NBT法測定)
引言：
SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，它們都催化下列反應(yīng):由于超氧自由基(02)為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子02-..-，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲躦(黃色)，繼而還原生成二甲躦，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長下有最da吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H結(jié)合生成H2O2和02，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲攢生成速度減慢。通過在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照--定時(shí)間后測定560nm波長下各液光密度值，抑制NBT光還原相對百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低。
儀器及試劑
美析UL-1000超微量紫外可見分光光度計(jì)
離心機(jī)
0.05mol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH7.8):
A母液: 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液:取NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分 別用蒸餾水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,
B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。
14.5mM甲硫氨酸溶液:稱取1.0818g Met用磷酸緩沖液(pH7.8)定容至500ml。
3mM EDTA-Na2溶液:稱取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。
60μM核黃素溶液:稱取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。
2.25mM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液:稱取0.092g NBT用PBS定容至50ml,避光保存。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.酶液提取
稱取0.5g (可視情況調(diào)整)樣品(新鮮葉片或根系)洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH7.8) 在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4C、12000g 下離心20min，.上清液即為SOD粗提液。
2.酶活性測定
(1)反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn)):分別取配好的Met溶液162ml,.EDTA-Na2溶液6ml，NBT 溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻;
(2)分別取2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml (可視情況調(diào)整)酶液于指形管中此即反應(yīng)管;同時(shí)做兩支對照管，其中1支試管加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml PBS (不加酶液)作為最da光還原管，另1支加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1mlPBS同時(shí)用錫箔紙包好遮光用于測定時(shí)調(diào)零。
(3)將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000lux光照25°C下反應(yīng)20min;
(4)反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對照管調(diào)零，分別測定各管在560nm下的吸光度(OD560 )
計(jì)算結(jié)果
已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一-個(gè)酶活單位(U),
按下式計(jì)算活性n=[(ODmax 0D560)/0Dmax]/2
SOD總活性= [( Ack-AE)XV]/ (1/2AckXWXVt)
SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量
SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW);比活力單位以酶單位每:毫克蛋白表示;
Ack 為照光對照管的吸光度;
AE 為樣品管的吸光度;
V為樣品液總體積(ml);
Vt 為測定時(shí)的酶液用量(ml); W為樣品鮮重(g);
蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。
注意事項(xiàng)
1.酶液提取須在4℃下進(jìn)行，提取后立即進(jìn)行測定，冰箱中放幾小時(shí)活性也會下降;
2.植物中的酚類物質(zhì)對測定有干擾，制備粗酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等，盡可能除去植物組織中的酚類等次生物質(zhì)。
3.NBT反應(yīng)液配好后過濾除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分搖勻然后使用。
4.加反應(yīng)液時(shí)最hao在暗光下進(jìn)行;
5.核黃素產(chǎn)生02，NBT還原為藍(lán)甲躦都與光照密切相關(guān)，照光強(qiáng)度和時(shí)間要嚴(yán)格控制。光照培養(yǎng)箱內(nèi)壁裱糊錫箔紙，使箱內(nèi)均勻光照約達(dá)40μ molms，同時(shí)使照光時(shí)間一一樣，選擇試管盡量- -致，照光結(jié)束后測-一個(gè)拿一個(gè)(最hao晚.上做) (溫度高時(shí)照光時(shí)間縮短，溫度低時(shí)延長);
6.測定活性時(shí)加入的酶量，以能抑制反應(yīng)的50%為佳。(一個(gè)酶單位相當(dāng)于引起反應(yīng)液達(dá)到半抑制時(shí)酶的用量,即以能抑制反應(yīng)50%的酶量為一個(gè)SOD酶活性單位。)(反應(yīng)液中加酶液與PBS調(diào)零差異不大，反應(yīng)液調(diào)零與其它兩個(gè)則有一定差異。)
關(guān)于美析
美析主營光譜類儀器：可見分光光度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)、原子吸收光譜儀、原子熒光光度計(jì)、ICP-AES、ICP-MS，生命科學(xué)儀器：超微量分光光度計(jì)、全自動核酸提取儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)美析利用在產(chǎn)品機(jī)械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計(jì)、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合市場的最xin實(shí)際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。
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