Bradford實驗的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的嗎？

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法）測蛋白濃度，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白定量方法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，操作簡便，反應(yīng)迅速且穩(wěn)定，靈敏度高，干擾因素少，因而得到廣泛的應(yīng)用。其原理是：考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，形成的復(fù)合物顏色深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系，因此可通過測定溶液在595nm處的光吸收度值來計算溶液中蛋白質(zhì)的含量。

然而，即便是Bradford本人，也觀察到反應(yīng)有一定程度的非線性，在蛋白濃度跨度變大時曲率就會漸漸變得明顯，只有在2-10 μg/ml（反應(yīng)液中的濃度）這一比較小的BSA濃度跨度下才適合繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個非線性是由染料自身的特性造成的，即染料與蛋白結(jié)合前后的吸收光譜有重疊。

游離的G250染料有多個光吸收峰。在反應(yīng)條件下，染料處于酸性環(huán)境中，此時染料有紅、藍(lán)、綠三種顏色形式，處于平衡狀態(tài)，這三種顏色形式分別對應(yīng)的吸收峰為470、590、650 nm。與蛋白結(jié)合的染料分子是藍(lán)色形式，吸收峰在590 nm，其與蛋白結(jié)合后產(chǎn)生的復(fù)合物吸收峰在594 nm。這也就意味著，在以594 nm波長進(jìn)行檢測時，有部分光吸收值是由游離染料產(chǎn)生的，這部分光吸收值是作為檢測背景存在的。在反應(yīng)過程中，隨著蛋白與染料的結(jié)合，游離染料分子的濃度下降，使得594 nm檢測背景值降低，從而引起線性關(guān)系的扭曲。下圖顯示了游離染料和染料-蛋白復(fù)合物的光吸收譜。

這種線性關(guān)系的扭曲，可以通過不同的計算方法進(jìn)行修正。由于游離染料的三種顏色形式處于平衡狀態(tài)，因此，可以通過在450 nm檢測紅色形式的染料，間接判斷594 nm檢測背景的下降程度。由于反應(yīng)過程中蛋白和游離染料的濃度變化都會對反應(yīng)的線性關(guān)系造成影響，根據(jù)比爾定律，采用OD594與OD450的比值進(jìn)行公式計算，可以獲得與蛋白濃度的線性關(guān)系，同時還可以提高蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以及一定程度上提高檢測靈敏度。實驗范例見下圖，理論推導(dǎo)過程在此省略，感興趣的朋友可閱讀下文所附的參考文獻(xiàn)。

（圖中BSA蛋白濃度為反應(yīng)液中的濃度）

使用OD594/OD450擬合時，需要注意，此時的背景值是指水的光吸收值，并非不含蛋白的染色液的光吸收值。如缺乏合適濾光片，也可使用590-600 nm和450-485 nm（染料-蛋白復(fù)合物在485 nm以下波長沒有光吸收）的任意波長進(jìn)行讀數(shù)。

參考文獻(xiàn)：Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies，ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 236, 302–308 (1996)