| 上海雷浩信息科技有限公司
主營產(chǎn)品： abcam抗體,cst抗體,bd抗體,胎牛血清,bd基質膠,感受態(tài)細胞,四季青胎牛血清 |
| 上海雷浩信息科技有限公司
主營產(chǎn)品： abcam抗體,cst抗體,bd抗體,胎牛血清,bd基質膠,感受態(tài)細胞,四季青胎牛血清 |
2015-12-23 閱讀(496)
人工構建的質粒缺乏轉移必需的基因,不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移.這時就需要誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外DNA.
質粒制備的必要,人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移.如需將質粒載體轉移進受體 細菌 ,需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA .
轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是 微生物 遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗基因細胞.
轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內切酶和 甲基化 酶的 突變 體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩(wěn)定地遺傳給后代.受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后, 細胞膜 的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞 (Compenent cells).進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀.將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞).目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率*可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛.
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長 狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)的細菌,從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液.細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制.DH5α菌株的OD600 為0.5時, 細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的細菌情況有所不同),這時比較合適.密度過高或不足均會影響轉化效率.
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA).轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低.1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和.一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％.
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處.
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩.
本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質粒共保溫,實現(xiàn)轉化.由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),可通過Amp抗性來篩選轉化子.如受體細胞沒有轉入pBS,則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長.能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS.轉化子擴增后,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑒定.
本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質粒共保溫,實現(xiàn)轉化.由于pBS質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),可通過Amp抗性來篩選轉化子.如受體細胞沒有轉入pBS,則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長.能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS.轉化子擴增后,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑒定.
