氯霉素檢測試劑盒使用說明書-齊一生物試劑盒
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氯霉素檢測試劑盒
使用說明書
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測水產(chǎn)組織、畜禽組
織、肝臟、蛋類、蜂蜜、牛奶、飼料及水等樣本中的氯霉素藥
物（Chloramphenicol，CAP） ，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶
標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢
測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的氯霉素藥物和酶標(biāo)板
上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，
用 TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氯霉素藥物含量成負(fù)
相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.025ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟、蜂蜜、牛奶……………0.0125ppb
蛋類、水樣……………………………0.05ppb
尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉……0.025ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
氯霉素 …………………………………100%
甲砜霉素、氟甲砜霉素………………＜0.1%
2.5 樣本回收率：
組織、肝臟……………………………85%±20%
蜂蜜、腸衣……………………………85%±25%
牛奶、飼料……………………………75%±25%
尿液、血清……………………………70%±20%
水樣……………………………………90%±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96 孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各 1ml
0ppb、 0.025ppb、 0.075ppb、 0.225ppb、 0.675ppb、 2.025ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋） ：100ppb………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液 A（白蓋）……………………6ml
底物液 B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X 復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩
器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）
4.2 微量移液器： 單道 20µl-200µl， 100µl-1000µl、 多道 300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、醋酸鈉、醋酸
、亞硝基鐵qing化鉀（K2Fe(CN)5(NO)?2H2O） 、葡萄糖苷酸酶、硫
酸鋅（ZnSO4·7H2O）
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實
驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液 1：0.36M 亞硝基鐵qing化鉀溶液（牛奶、奶粉樣本）
11.9g 亞硝基鐵qing化鉀加去離子水至 100ml 溶解。
配液 2：1.04M 硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）
29.8g 硫酸鋅加去離子水至 100ml 溶解。
配液 3：0.1M pH4.8 醋酸鈉緩沖液（尿液樣本）
2.4g 醋酸鈉加去離子水 500ml 溶解，加 1.2ml 醋酸混勻。
配液 4：乙腈-水溶液
V 乙腈:V 水=84:16
配液 5：復(fù)溶液（若檢測樣本為水樣，請勿稀釋，直接使用）
將 2×復(fù)溶液用去離子水 2 倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)
溶液在 4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織、魚、蝦、肝臟樣本處理方法
1）稱取均質(zhì)后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中，先加入3ml
去離子水振蕩混勻， 再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘， 室溫4000
轉(zhuǎn)/分離心 10分鐘；
2）取上層液體 2ml在 50-60℃下氮氣吹干；
3）用 1ml 正己烷溶解干燥的殘渣，再加入 0.5ml 復(fù)溶液，混
合 30 秒，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.0125ppb
5.3.2 血清、血漿樣本處理方法
1）取 1ml血清或血漿至離心管中，加入 2ml 乙酸乙酯振蕩 1
分鐘，室溫 4000轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘，或靜置使水相與有機相分
離；
2）取全部上層液體在 50-60℃下氮氣吹干；
3）用 1ml 正己烷溶解干燥的殘渣，再加入 1ml 復(fù)溶液，混合
30 秒，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.025ppb
5.3.3 尿液樣本處理方法
1） 取2ml尿液至離心管中， 加入0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液0.5ml
混合，加40ul 葡萄糖苷酸酶，混勻，37℃水解 2 小時以上

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過夜） ；
2）將上述溶液恢復(fù)至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯振蕩 1 分鐘，
室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘， 取4ml 上層液體在 50-60℃下氮
氣吹干；
3）用 1ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘渣，混勻；
4）取 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.025ppb
5.3.4 蜂蜜樣本處理方法
1）取 2±0.05g 蜂蜜于離心管中，用 4ml去離子水溶解，加入
4ml 乙酸乙酯振蕩 2 分鐘，室溫 4000轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘；
2）取上層液體 2ml 在 50-60℃下氮氣吹干；
3）用 0.5ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘渣，混勻；
4）取 50μl 進行分析。
氯霉素檢測試劑盒使用說明書-齊一生物試劑盒樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.0125ppb
（檢測下限 0.0125ppb，定量下限 0.05ppb，因某些樣本
有干擾建議以 0.05ppb 作為陽性判定值）
5.3.5 腸衣樣本處理方法
1）腸衣經(jīng)清洗后均質(zhì)，稱取均質(zhì)后的樣本 1±0.05g 于 50ml
離心管中，加入 10ml乙酸乙酯振蕩 2 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分
離心 10 分鐘；
2）取上層液體 5ml 在 50-60℃下氮氣吹干；
3）用 1ml 正己烷溶解干燥的殘渣，再加入 0.5ml 復(fù)溶液，混
合 30 秒，室溫 4000轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.025ppb
5.3.6 牛奶樣本處理方法
1）將牛奶樣本 15℃4000轉(zhuǎn)/分離心 10分鐘，去除上層脂肪，
取 5ml 去脂肪奶樣于 50ml 離心管中，加 250ul 亞硝基鐵氰化
鉀溶液（配液 1）振蕩混合 30 秒，加 250ul 硫酸鋅溶液（配
液 2）振蕩混合 30 秒，15℃4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
2）取上層液體 2.2ml（相當(dāng)于 2ml 鮮奶）于另一離心管中，加
入 4ml乙酸乙酯振蕩 2 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
3）取上層液體 2ml在 50-60℃下氮氣吹干；
4）用 0.5ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘渣，混勻；
5）取 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.0125ppb
（檢測下限 0.0125ppb，定量下限 0.025ppb，因某些樣本
有干擾建議以 0.075ppb作為陽性判定值）
5.3.7 奶粉樣本處理方法
1） 取 2±0.05g 奶粉于50ml 離心管中， 用 10ml去離子水溶解，
加入1ml 亞硝基鐵qing化鉀溶液 （配液 1） 和1ml 硫酸鋅溶液 （配
液 2）振蕩混合，15℃4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
2）取上層液體 3.6ml（相當(dāng)于 0.6g 奶粉）于另一離心管中，
加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5 分鐘，室溫 4000轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
3）取上層液體 4ml在 50-60℃下氮氣吹干；
4）用 0.4ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘渣，混勻；
5）取 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.025ppb
（檢測下限 0.025ppb，定量下限 0.075ppb，因某些樣本有干
擾建議以 0.075ppb作為陽性判定值）
5.3.8 蛋類樣本處理方法
1）取 3±0.05g 均質(zhì)的蛋類樣本于 50ml 離心管中，加 9ml 乙
腈-水溶液振蕩混合 2 分鐘，15℃4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
2）取上層液體 3ml 于另一離心管中，加入 3ml 去離子水，再
加 4.5ml 乙酸乙酯振蕩 1 分鐘，15℃4000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘；
3）取全部上層液體在 50-60℃下氮氣吹干；
4）用 1ml 正己烷溶解干燥的殘渣，再加入 2ml 復(fù)溶液，混合
30 秒，室溫 4000轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測下限：0.05ppb
（檢測下限 0.05ppb，定量下限 0.15ppb）
5.3.9 飼料樣本處理方法
1）取 2±0.05g 均質(zhì)的飼料于 50ml 離心管中，用 2ml 去離子
水溶解，再加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 2 分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離
心 10 分鐘；
2）取上層液體 3ml載 50-60℃下氮氣吹干；
3）用 1ml 正己烷溶解干燥的殘渣，再加入 1ml 復(fù)溶液，混合
30 秒，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.025ppb
5.3.10 水樣本處理方法
1）取 0.5ml 澄清水樣于 1.5ml 離心管中，加入0.5ml 2×濃縮
復(fù)溶液，振蕩 1 分鐘；
2）取 50μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測下限：0.05ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡 30min
以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，
每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框
架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將 20×濃縮洗滌液按 20 倍稀釋
成工作洗滌液。
6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本
和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然
后加抗體工作液 50µl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光反應(yīng)
30 分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液 250µl/孔充分
洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被齊一生物科技（上海）有限公司 

清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破） 。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物 100µl/孔，25℃避光反應(yīng) 30分鐘。
6.5 洗 滌：同上
6.6 顯 色：加底物液 A 50µl/孔，再加底物液 B 50µl/孔，
輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘。
6.7 終 止：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，終止反
應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議
用雙波長 450/630nm） 。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸
光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度
值，再乘以 100%，即
百分吸光度值（%）＝ A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）
的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分
吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃
度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的
準(zhǔn)確、快速分析。 （索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致
所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲
線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行
下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很
大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中， 用蓋板膜封住微孔板， 避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試
劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標(biāo)準(zhǔn)的吸光
度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
【生產(chǎn)企業(yè)】
企業(yè)名稱：齊一生物科技（上海）有限公司
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