上海武昊公司*：071409Ra， ELISA Kit for Hemoglobin （HB）
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
[預期應用]
本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清 或其它相關生物液體中待檢測指標含量。
[試劑盒內(nèi)容]
| 試劑名稱 | 數(shù)量 | 試劑名稱 | 數(shù)量 |
| 96孔板（預包被） | 1 | 96孔板覆膜 | 4 |
| 標準品（液體） | 2 | 標準品稀釋液 | 1×20mL |
| 檢測溶液A（綠色） | 1×120μL | 檢測稀釋液A（2×） | 1×6mL |
| 檢測溶液B（紅色） | 1×120μL | 檢測稀釋液B（2×） | 1×6mL |
| TMB底物 | 1×9mL | 終止液 | 1×6mL |
| 濃洗滌液（30×） | 1×20mL | 使用說明書 | 1 |
[標本的采集與保存]
1、 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4oC過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20oC或-80oC保存，但應避免反復凍融。
2、 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8oC 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨?/span>置于-20oC或-80oC保存，但應避免反復凍融。
3、 組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL預冷PBS進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測。
4、 細胞培養(yǎng)上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20oC或-80oC保存，但應避免反復凍融。
注意：
1、 以上標本均需密封保存，4oC保存應小于1周，-20oC不應超過1個月，-80oC不應超過2個月。
2、 標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
3、 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。[操作步驟]
1、 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品（見試劑準備2）。空白孔加100μL（見試劑準備第二步zui后一管），余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37oC溫育2小時。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37oC溫育1小時。
4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復洗板3次。zui后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。
5、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37oC溫育30分鐘。
6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。
7、 每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37oC避光顯色（反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9、 在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（O.D.值）。
注意：
1、 試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。*設置復孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。
5、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
6、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、 如果實驗室內(nèi)濕度低于60%，*使用加濕器提高濕度水平。
[實驗原理]
將待檢測抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的待檢測指標與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的待檢測抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待檢測指標呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。
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