1．說明
本檢測采用酶聯(lián)免疫法定量檢測神經(jīng)性貝毒的存在。神經(jīng)性貝毒是一種毒素，與貝殼類動物的神經(jīng)中毒有關(guān)。本檢測可用于水產(chǎn)樣本對貝類毒素的定性和定量檢測，例如甲殼類動物的樣本。對于甲殼類動物的需要提前制備樣本。如果條件允許，陽性樣本可以做HPLC，GC/MS或其他方法確認(rèn)。
2．安全性說明
標(biāo)準(zhǔn)品溶液含有少量的神經(jīng)性貝毒。底物溶液含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液還有稀硫酸。避免皮膚與粘膜與終止液接觸。若終止液與皮膚接觸，可用水洗去。
3．貯藏與穩(wěn)定性
試劑盒貯存在4-8°C。使用前試劑盒中溶液要恢復(fù)到室溫20—25度。在保質(zhì)期內(nèi)試劑盒都可以正常使用。
4．檢測原理
本實驗采用直接競爭ELISA方法，用特異性抗體識別神經(jīng)性貝毒。樣本中的神經(jīng)性貝毒可與貝毒-酶-結(jié)合物競爭，同包被在微孔板上的羊抗-神經(jīng)性貝毒抗體結(jié)合。洗板加入底物溶液，顯藍(lán)色。藍(lán)色的深度與神經(jīng)性貝毒在樣本中的濃度成反比。顏色反應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)終止，顏色用酶標(biāo)儀讀值。每孔的樣本濃度值可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來讀取。
A 試劑盒包括
1. 包被綿羊抗-神經(jīng)性貝毒的酶標(biāo)板
2. 標(biāo)準(zhǔn)品PbTx-3 （8）: 0, 0.010, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.0 ng/ml
3. 辣根過氧化酶（HRP）-神經(jīng)性貝毒結(jié)合物，6ml
4. 濃縮的樣本稀釋液（1X）2 X 30ml,用于稀釋樣本
5. 濃縮的洗液（5X），100ml
6. 顯色液（TMB）,12ml
7. 終止液，2 X 6ml
8.海水前處理溶液25ml
C 檢測步驟
1. 按照既定計劃，在放置有酶標(biāo)條的孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或者海水或者甲殼類樣本提取液50цl。*做雙份或者三分重復(fù)。
2. 用多道移液器或者可調(diào)移液器連續(xù)加入50цl的酶結(jié)合物于各微孔孔中。封板，放置在振蕩器上震蕩30秒。防止濺出。室溫孵育60分鐘。
3. 孵育完畢，揭開板子，強(qiáng)烈搖起板孔中的沉淀。1X洗液洗板3次。每孔每次zui少用250цl的洗液洗滌。殘留的液體需要放置在干凈的紙上拍干。
4. 每孔加入100цl的底物溶液。室溫30分鐘孵育。避免直接光照。
5. 按照加入底物溶液的順序，每孔依次加入100цl的終止液。
6. 加入終止液后15分鐘內(nèi)450nm讀取吸光值。
D 結(jié)果分析
結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件（4-parameters,Logit/Log）。手工計算可以先計算標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值的平均值，然后計算每個標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0（用其它標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值除以零標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值乘以*）。以每個標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0做Y軸，以每個標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)性貝毒的濃度做X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，把對照和樣品的%B/B0代入標(biāo)準(zhǔn)可以計算出樣品中神經(jīng)性貝毒的濃度。樣品中神經(jīng)性貝毒的含量小于0.01 ppb認(rèn)為陰性。當(dāng)樣品中神經(jīng)性貝毒的含量大于2.0 ppb要稀釋后再測定。
