核酸是一切生物都含有的存在于細(xì)胞核的重要成分, 是生命現(xiàn)象中的生物大分子, 也是生物遺傳信息的載體,它控制著蛋白質(zhì)的合成和有機(jī)體細(xì)胞的機(jī)能, 在生物的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命活動中占有極其重要的地位. 隨著分子生物學(xué)的廣泛應(yīng)用, 核酸定量已經(jīng)成為一種常規(guī)化的實(shí)驗(yàn)手段。
核酸定量原理：
DNA/RNA 的分光光度法測定
DNA 或RNA 的分光光度法測定核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg / mL 的dsDNA，37μg / mL 的ssDNA， 40μg/mL 的RNA，30μg/mL 的寡核苷酸。為了保持定量結(jié)果穩(wěn)定，樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）要求吸光值在0.1-1.5 A。
分光光度計(jì)顯示的比值表示樣品的純度，蛋白的吸收峰是280 nm，純凈的樣品260/280 nm比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230 表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、酚鹽離子或硫氰酸鹽等，較純凈的核酸A260/A230 的比值大于2.0 。A320 檢測溶液的顆粒度、混濁度和其他干擾因子。純樣品的A320 一般是 0。水飽和酚在270nm 處有特征吸收，無酚的核酸制品A260/A270 比值約為1：2。
DNA/RNA 的熒光測定
用熒光測定法分析核酸濃度操作簡便而且比分光光度法靈敏，可測定納克級水平的DNA。Hoechst33258 對小分子DNA 的結(jié)合能力較弱，這種方法只能用來測定長度超過1kb的DNA 溶液的濃度。測定時(shí)，將濃度已知和未知的DNA 制品與熒光染料保溫，把未知樣品的吸收值與一系列濃度已知樣品的吸收值相比較，得未知樣品的濃度。
Picogreen 染料是一種新型的dsDNA 染料：其檢測靈敏度高，可檢測到pg 級DNA；檢測范圍寬，可跨越４個(gè)數(shù)量級；特異性好，基本不受ssDNA 和RNA 的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。目前使用Picogreen 染料定量檢測DNA 已經(jīng)廣泛用于生物學(xué)檢測，并被2010 年版《中華人民共和國藥典》選為藥物殘留DNA 定量方法。
當(dāng)樣品DNA 含量不足以通過分光光度法測定，DNA 嚴(yán)重污染有吸收紫外射線的其他雜質(zhì)而妨礙準(zhǔn)確測定，一個(gè)快速的辦法是利用溴化乙錠嵌入DNA 分子中后由紫外激發(fā)的熒光來估測這種樣品中DNA 的含量。由于熒光強(qiáng)度與DNA 總量成正比，可通過比較樣品和一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的熒光估測DNA 含量。
RiboGreen RNA 定量試劑是一種超靈敏的核酸熒光染料，使用這種染料可以對溶液中的RNA 進(jìn)行簡單快速的定量。當(dāng)RiboGreen 熒光染料處于溶液狀態(tài)時(shí)，其幾乎沒有熒光活性；當(dāng)RiboGreen 與RNA 結(jié)合，其熒光活性將增加1000 倍。RiboGreen-RNA 復(fù)合物的熒光激發(fā)波長約500nm，發(fā)射波長約525nm。使用RiboGreen 熒光染料可以檢測到2.5ng/mL 的RNA，這比260nm 吸收法要高出千倍。
Biotek核酸定量解決方案
對于樣品較純（即蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖以及其他核酸等雜質(zhì)含量較低時(shí)），可通過微孔板分光光度法測定其吸收紫外線的量，既簡便又準(zhǔn)確，使用Biotek—Eon、Epoch、Epoch2微孔板分光光度計(jì)可以得到精確的數(shù)據(jù)，并且可選配Take3微量檢測板進(jìn)行高通量超微量核酸定量，最多一次48個(gè)樣品、最少上樣量2μl。

對于樣品中DNA 或RNA 含量較低或含有較多雜質(zhì)，則可以通過溴化乙錠或Hoechst 33258 等熒光染料所發(fā)出的熒光估測核酸的含量，使用Biotek——FLX800、SynergyH1、HTX等進(jìn)行精準(zhǔn)的熒光核酸定量，并可配備Take3進(jìn)行高通量超微量熒光核酸定量實(shí)驗(yàn)。

在熒光檢測模式下，染料特異性的濾光片和帶寬選擇，可以為所有應(yīng)用提供的檢測靈敏度，無論采用何種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，光路系統(tǒng)均可以適應(yīng)其光譜特性

BioTek產(chǎn)品以靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便等深得用戶信任，無論是哪種定量方法，Biotek總能提供準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，為您實(shí)驗(yàn)室核酸定量保駕護(hù)航。
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