FDA的William Hallett博士曾在2016年的CHI年度會(huì)議上專(zhuān)題報(bào)告講述了蛋白聚集體對(duì)免疫原性的影響1。報(bào)告中提到：在生產(chǎn)過(guò)程、產(chǎn)品運(yùn)輸、儲(chǔ)存和交付過(guò)程中，均可能導(dǎo)致蛋白聚體的形成。由于聚集體可能引起免疫原性，因此聚集體的含量控制是關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。
隨著抗體藥的發(fā)展突飛猛進(jìn)，抗體的靶點(diǎn)由單一靶向轉(zhuǎn)向多位靶向，抗體開(kāi)發(fā)趨勢(shì)也呈現(xiàn)多樣化，更多轉(zhuǎn)向利用雙特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)等技術(shù)做創(chuàng)新藥的開(kāi)發(fā)；多元化的新藥開(kāi)發(fā)也為下游純化工藝帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)。針對(duì)聚集體等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的去除成為必須克服的工藝難點(diǎn)。本文將針對(duì)使用不同層析原理去除聚集體的策略進(jìn)行分享：
蛋白A親和層析MaXtar ARPA：
添加劑助力聚集體去除
蛋白A親和層析被廣泛用于抗體純化的捕獲步驟。由于蛋白A通過(guò)Fc區(qū)特異性結(jié)合抗體，這一步可以顯著減少過(guò)程相關(guān)雜質(zhì)，包括宿主細(xì)胞蛋白和核酸。然而，在典型條件下，蛋白A色譜法去除聚集體的效果較差，已知聚集體比單體結(jié)合更強(qiáng)，單獨(dú)調(diào)節(jié)洗脫pH通常不足以實(shí)現(xiàn)良好的分離。因此，在許多情況下，聚集體的去除往往依靠后續(xù)離子交換層析或多模式層析，案例分別介紹：洗滌和洗脫緩沖液中加入氯化鈣/聚乙二醇(PEG)或氯化鈉/聚乙二醇(PEG)組合，可以顯著提高蛋白質(zhì)A的聚集體去除能力，鹽和PEG的協(xié)同作用促進(jìn)單體與聚集體有效分離。
樣品信息：澄清后培養(yǎng)液
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4
洗滌Buffer: 50 mM NaAc-HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 5.5;
Or 50 mM NaAc-HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 5.5
洗脫Buffer: 50 mM HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 3.1; Or 50 mM HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 3.1
圖1： 添加500mM CaCl2和5%PEG的蛋白A純化圖譜
圖2： 未優(yōu)化和優(yōu)化方案下蛋白A層析疊加圖
小結(jié)
圖1和圖22可見(jiàn)，洗滌和洗脫緩沖液中加入500mM CaCl2和5%PEG，或者750 mM氯化鈉和5% PEG顯著提高單體-聚集體的分離，SEC純度有明顯提高。
多模式陰離子MaXtar MMA:
通過(guò)流穿模式去除聚集體
MaXtar MMA 是一款強(qiáng)陰離子的多模式填料，配基通過(guò)多種作用與目標(biāo)分子結(jié)合，如離子作用、疏水作用和氫鍵作用。MMA經(jīng)常用于抗體純化中的精純階段，可以去除聚集體、蛋白A配基、HCP、DNA 和病毒等多種雜質(zhì)。
樣品信息：雙抗ProteinA洗脫液，聚集體含量11%
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, pH 7.5
上樣：Protein A洗脫液(pH調(diào)節(jié)到7.5)(載量80 mg/ml)
淋洗Buffer: 50mM Tris-HCl, pH7.5
圖3： MaXtar MMA層析圖譜
小結(jié)
SEC結(jié)果表明，雙抗的聚集體含量由 11% 下降到至 1.6%。
多模式陽(yáng)離子MaXtar MMC HR:
通過(guò)結(jié)合模式去除聚集體
MaXtar MMC HR是一款多模式弱陽(yáng)離子填料，用于抗體的精細(xì)純化，可以達(dá)到去除聚集體、降解片段等多種雜質(zhì)。
圖43：多模式層析圖譜
圖53：SEC檢測(cè)圖譜
小結(jié)
SEC 結(jié)果顯示，雙抗的聚集體含量由 9.6% 下降到了 1.2%。電泳圖顯示，除聚集體外，輕鏈缺失的降解片段同樣具有很好的去除效果。
疏水層析:去除聚集體
聚集體的疏水性比單體要強(qiáng)，選擇高分辨率的MaXtar Phenyl HR，可以高效去除聚集體。
圖64：未優(yōu)化和優(yōu)化方案下的高分辨率的Phenyl洗脫圖譜
小結(jié)
圖6可見(jiàn)Phenyl洗脫純度都可以達(dá)到98%以上，同時(shí)可以通過(guò)添加己二醇/精氨酸的方式提高收率。對(duì)于自身疏水性比較強(qiáng)的雙抗分子，建議可以選擇疏水性較弱的填料(MaXtar Octyl/Butyl)，使目的雙抗流穿，聚體結(jié)合。
參考文獻(xiàn)
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