特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品(foods for special medical purpose, FSMP)，簡(jiǎn)稱特醫(yī)食品。我國(guó)特醫(yī)食品行業(yè)由于起步較晚，目前規(guī)模相對(duì)較小，但是近年來(lái)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)，截至2024年7月1日，共有192款特醫(yī)食品獲批，第一季度與第二季度分別新增特醫(yī)食品17款與11款。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則中明確規(guī)定多種維生素含量。其中維生素A和D是人體生長(zhǎng)發(fā)育的必需物質(zhì)，尤其對(duì)胎兒、嬰幼兒的發(fā)育，上皮組織的完整性，視力，生殖器官，血鈣和磷的恒定，骨骼、牙的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。維生素E是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，能抑制不飽和脂肪酸的氧化，減少過氧化脂質(zhì)的形成以及對(duì)機(jī)體生物膜的損害，有抗衰老、抗癌及防止動(dòng)脈粥樣硬化作用 [1]。
目前有關(guān)配方食品中，維生素 ADE 的測(cè)定方法較多，其中操 作步驟中對(duì)于脂溶性維生素基本都要經(jīng)過皂化、提取、洗滌、 濃縮等復(fù)雜的前處理步驟，并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)一個(gè)方法完成以上幾 種維生素的同時(shí)測(cè)定。賽默飛液相團(tuán)隊(duì)從 2010 年開始嘗試?yán)?用特色的雙三元液相系統(tǒng)，結(jié)合二維色譜實(shí)現(xiàn)維生素 A、維生素 D2、D3 以及維生素 E 四種同分異構(gòu)體的同時(shí)測(cè)定，前后共推出六代方法對(duì)該方案進(jìn)行不斷優(yōu)化。本文在先前研究的[2]基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化模塊配置、流動(dòng)相組成、色譜柱型號(hào)、方法梯度等，提高了方法穩(wěn)定性以及幾種維生素的分離度，并在二維色譜的基礎(chǔ)上，通過增加在線固相萃取的設(shè)定，將傳統(tǒng)的人工液液萃取、洗滌和干燥濃縮等步驟同時(shí)轉(zhuǎn)移到儀器自動(dòng)完成， 大大簡(jiǎn)化了前處理過程，減少有機(jī)溶劑的使用以及與實(shí)驗(yàn)人員的接觸，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)更加環(huán)保，大大降低實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)也提高了實(shí)驗(yàn)的安全性。
實(shí)驗(yàn)部分
儀器：ThermoFisher Vanquish Core 高效液相色譜儀 SPE 泵：Vanquish Quaternary Pump (VC-P20-A-01) 一維、二維泵：Vanquish Dual Pump (VC-P33-A-01) 自動(dòng)進(jìn)樣器：Vanquish sampler CT (VC-A12-A-02, 100μL 定 量環(huán)) 柱溫箱：Vanquish Column Compartment C(VC-C10-A-03， 含兩個(gè) 2p-6p 切換閥) 檢測(cè)器：Variable Wavelength Detector C(VC-D40-A-01, 含11μL流通池) Vanquish Diode Array Detector HL (VH-D10-A, 含 60mm 流通池)
色譜軟件：Chromeleon Chromatography Data System7.3.1
樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：參考AN_24019_HPLC 在線固相萃取聯(lián)用二維液相色譜測(cè)定食品中維生素 A、D、E及異構(gòu)體含量
在線固相萃取-二維液相色譜法測(cè)定
在線固相萃取-二維液相色譜(Online SPE-2D-LC)系統(tǒng)連接見圖1所示
(1D, 第一維; 2D, 第二維; SPE, 在線固相萃取柱; Trap, 捕集柱)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論：
對(duì)照品和樣品溶液譜圖
維生素A、維生素E四個(gè)同分異構(gòu)體和維生素D2、維生素D3對(duì)照品和樣品溶液一維和二維分析譜圖見圖2-a、b、c。
圖2a 維生素A對(duì)照品及樣品一維325 nm譜圖(上圖為對(duì)照品，下圖為樣品)
圖2b 維生素E對(duì)照品及樣品一維294 nm譜圖(上圖為樣品，下圖為對(duì)照品)
圖2c 維生素D對(duì)照品及樣品一維 264 nm譜圖(上圖為對(duì)照品，下圖為樣品)
線性及靈敏度
按照表1標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度配置溶液，分別進(jìn)樣100μL，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，考察方法的線性范圍及定量限。結(jié)果顯示，各維生素在其濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均>0.999。方法靈敏度較高，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，方法線性及檢測(cè)限(S/N>3)結(jié)果見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，最低濃度的分離圖譜見圖5。
表3 方法線性及靈敏度
精密度
采用7#濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6針考察精密度。結(jié)果如表4所示，6針樣品各峰的峰面積RSD%均小于0.31%，滿足方法要求，體現(xiàn)Vanquish Core液相色譜良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。見表4。
表4 樣品連續(xù)進(jìn)樣結(jié)果(n=6)
回收率
取一定量的樣品，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)液，按照2.5.2前處理后，分別測(cè)定維生素ADE的含量，計(jì)算出樣品與標(biāo)準(zhǔn)濃度扣除樣品濃度后的加標(biāo)回收率。見表5。
表5 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)
樣品測(cè)試結(jié)果
采用上述方法對(duì)市售配方奶粉和特殊醫(yī)學(xué)配方食品樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表6顯示，樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)維生素測(cè)試無(wú)干擾，表明方法適合不同食品中維生素A、D、E含量的測(cè)定。
表6 樣品測(cè)試結(jié)果
結(jié)論
本文采用賽默飛Vanquish Core液相色譜，在前期數(shù)代二維液相色譜同時(shí)測(cè)定食品中維生素A、D、E方案基礎(chǔ)上，建立了一種皂化液直接稀釋上樣，測(cè)定維生素A、維生素D2、D3以及維生素E四種同分異構(gòu)體的方法。該方法采用全自動(dòng)在線SPE結(jié)合中心切割二維液相色譜取代傳統(tǒng)的液液萃取和進(jìn)一步純化，簡(jiǎn)化了樣品的整個(gè)分析工作流程。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法靈敏度、線性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度均良好。實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化樣品前處理過程，縮短樣品分析周期，大幅提高了分析效率及降低實(shí)驗(yàn)成本。利用賽默飛獨(dú)特的雙三元液相，模塊搭建更緊湊，一套液相的臺(tái)面占地可以完成多套液相的測(cè)試工作，為企業(yè)節(jié)省了空間及時(shí)間成本。
參考文獻(xiàn)：
[1] 宋前流，陳群. 用藥護(hù)理. 北京. 人民軍醫(yī)出版社. 2014. 353-355頁(yè)
[2] AN_20071_HPLC. 在線固相萃取-二維液相色譜法分析配方奶粉中的維生素A、D和E異構(gòu)體含量.
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