1.原理
蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質分解,分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后,再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質的含量。
2.試劑
所有度劑均用不含氨的蒸餾水配制。
(1)硫酸銅(CuSO4•5H2O);
(2)硫酸鉀;
(3)硫酸;
(4)硼酸溶液(20g/L);
(5)混合指示液:1份(1g/L)甲基紅乙醇溶液與5份1g/L溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份(1g/L)甲基紅乙醇溶液與1份1g/L次甲基藍乙醇溶液,臨用時混合。
(6)氫氧化鈉溶液(400g/L);
(7)標準滴定溶液:硫酸標準溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L]或鹽酸標準溶液[c(HCI)=0.0500moL/L]。
3.儀器
定氮蒸餾裝置如圖所示。
4.操作方法
(1)樣品處理:精密稱取0.02-2.00g固體樣品或2.00-5.00g半固體樣品或吸取10.00-20.00mL液體樣品(約相當于氮30-40mg),移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中,加入0.2g硫酸銅,3g硫酸鉀及20mL硫酸,稍搖勻后于瓶口放一小漏斗,將瓶以45°斜于于小孔的石棉網(wǎng)上,小心加熱,待內容物全部碳化,泡沫*停止后,加強火力,并保持瓶內液體微沸,至液體呈藍綠色澄清透明后,再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷,小心加20mL水,放冷后,移入100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。同時做試劑空白試驗。
(2)按圖1-1裝好定氮裝置,于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水至約三分之二處,加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸,用調壓器控制,加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水。
1一電熱套;2一水蒸氣發(fā)生器(1L圓底燒瓶);3一螺旋夾;4一小玻杯及棒狀玻塞;
5一反應室;6一反應室外層;7~橡皮管及螺旋夾;8一冷凝管:9一蒸餾液接收瓶
(3)向接收瓶內加入10mL 20g/L硼酸溶液及混合指示劑1-2滴,并使冷凝管下端插入液面下,吸取10.0mL樣品消化稀釋液,由小漏斗流入反應室,并以10mL水洗滌小燒杯使流入反應室內,塞緊小玻杯的棒狀玻塞,將10mL 400g/L氫氧化鈉溶液倒入小玻杯,提起玻塞,使其緩慢流入反應室,立即將玻塞蓋緊,并加水于小燒杯中,以防漏氣,夾緊螺旋夾7,開始蒸餾,蒸氣通入反應室,使氨通過冷凝管而入接收瓶內,蒸餾5min,移動接收瓶,使冷凝管下端離開液面,再蒸餾1min,然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以硫酸或鹽酸標準溶液(0.05moL/L)滴定至灰色或藍紫色為終點。同時準確吸取10mL試劑空白消化液按(3)操作。
5.計算
……………………………(1-1)
式中:X---樣品中蛋白質的含量,g/100g(g/100mL);
V1---樣品消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積,mL;
V2---試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積,mL;
c---硫酸或鹽酸標準溶液的濃度,moL/L;
0.014---1.00mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或鹽酸[c(HCI)=1.000moL/L]標準溶液中相當?shù)牡馁|量,g;
m---樣品的質量(或體積),g或mL;
F---氮換算為蛋白質的系數(shù)。一般食物為6.25;乳制品為6.38;面粉為5.70;玉米、高梁為6.24;花生為5.46;米為5.95;大豆及其制品為5.71;肉與肉制品為6.25;大麥、小米、蒸麥、燕麥、裸麥為5.83;芝麻、向日葵為5.30。
6.說明
(1) 凱氏定氮法測定氮的含量,依據(jù)蛋白質中含氮的多少,換算為蛋白質的含量。
(2) 消化過程中,加入硫酸鉀可以提高反應溫度,加入硫酸銅作為催化劑,提高反應速度。
(3) 蒸餾過程中,不能使系統(tǒng)漏氣,放入堿液時,應小心、緩慢。
(4) 食品中含氮量一般為15%-17.6%,根據(jù)不同食品含氮量略有差異,采用不同的換算系數(shù)。以上換算系數(shù)是食品中含氮量為16%的氮換算為蛋白質的系數(shù)。
(5) 食品中還有非蛋白質物質含氮,故用此法測定蛋白質稱為粗蛋白。
(6) 蒸餾時,蒸汽發(fā)生要充足,均勻,加堿要夠量,動作要快,防止氨損失。冷凝管出口應浸入吸收液中,防止氨損失。
(7) 我國規(guī)定含乳飲料中蛋白質≥1.0%。