篤瑪 長春胺 產(chǎn)品信息

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常用標簽包括有Flag、myc、HA、His、GST、GFP、MBP等。
Flag標簽系統(tǒng)利用一個短的親水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目標蛋白；其純化條件是非變性的，因此可以純化所有有活性的融合蛋白。
His標簽是由6個組氨酸（His-His-His-His-His-His）組成的短肽，專門設(shè)計用于重組蛋白的吸附純化。由于分子量小，且較容易分離和純化，是目前使用廣泛的一種。
GST標簽體系具有蛋白表達率高，表達產(chǎn)物純化方便，利于GST抗體制備的特點。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可從細菌裂解液中提取，在不變性的條件下通過親和層析得到。
GFP或其突變體EGFP等廣泛用于基因表達效率的檢測，以及和目的蛋白融合表達用于檢測目的蛋白的表達和分別。GFP抗體不經(jīng)可以檢測GFP或其適當?shù)耐蛔凅w，也可以檢測和GFP或其適當?shù)耐蛔凅w融合表達蛋白的表達、細胞定位，以及純化、定性或定量檢測GFP融合表達蛋白等。
Myc標簽（序列為：EQKLISEEDL）已成功應(yīng)用于WB雜交技術(shù)、免疫沉淀IP和流式細胞術(shù)中。因此可用于檢測重組蛋白在細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳細胞中的表達情況。Myc重組蛋白質(zhì)可通過偶聯(lián)Myc標簽抗體到活化的瓊脂糖上而進行親和純化。但Myc重組蛋白的低pH洗脫條件往往會降低蛋白質(zhì)的活力，因此Myc標簽系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于檢測但很少用于純化。
HA標簽系統(tǒng)利用一個HA（influenza hemagglutintin epitope:YPYDVPDYA）短肽融合到目標蛋白。HA標簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種細胞類型，相應(yīng)的HA標簽抗體也被廣泛運用。
MBP標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端?？捎肕BP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測MBP標簽標記的重組蛋白。
其余標簽抗體還有V5、GFP、RFP、β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、ERK1、AU1、Avi、B、CBP、DDDDK、E、E2、Glu-Glu、HAT、HPC4、HSV、KT3、KLH、MAT、Protein A、S、S1、SNAP、SRT、NWSHPQFEK、SUMO、T7、Tag-100、TAP、Trx、Ty1、TF、Universal、VSV-G等，但應(yīng)用相對較少。



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操作步驟
1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.  設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入終止液50μL，15min，在450nm波長處測定各孔的OD值。
    
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標本的采集及保存
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘配制。
如配制150 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時配制。